寡核苷酸药物（oligonucleotide，Oligo）通过直接调控基因表达，调节蛋白质功能，已成为新药研发的热点领域。相较于小分子药物，其具有设计靶点明确、特异性高、研发周期短等优势。目前研究热点主要聚焦于小干扰RNA（siRNA）和反义寡核苷酸（ASO）两类分子。2025年，FDA先后批准siRNA药物Fitusiran（用于血友病A/B预防）、Plozasiran（用于降低家族性乳糜微粒血症）和ASO药物Donidalorsen（用于遗传性血管性水肿预防），为患者带来新选择。临床开发的ASO主要分为PS-ASO（硫代磷酸酯修饰的ASO）和PMO（磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸）[1]两类。
2023年，工业界发布的寡核苷酸药物非临床ADME研究白皮书[2]指出，其研究思路可参考小分子药物，但需灵活调整研究范围与节点。放射性示踪标记除了在小分子药物ADME研究中应用广泛外，其在寡核苷酸领域同样具有重要价值。白皮书推荐在以下5种场景下开展放射性物质平衡研究：
灵敏度不足：局部给药等极低剂量，非放射性方法灵敏度不够时；
非常规排泄途径：粪便排泄为主要清除途径时，需精确定量；
分子创新开发：全新平台或修饰类型需提供深入的ADME信息；
人体剂量推算：为临床物质平衡研究提供关键剂量学依据；
组织滞留过长：动物实验显示组织滞留过长，无法安全开展人体放射性PK研究。
2024年11月，FDA发布《寡核苷酸类治疗药物非临床安全性评价》指导原则，明确要求充分阐明ADME特征，以支持安全性评价和临床试验设计。
放射性示踪标记是一种广泛应用于研究小分子、多肽、寡核苷酸及ADC等药物体内ADME特性的技术，具有特异性强、稳定性好、灵敏度高、应用广泛等优点。附表A汇总了截至2026年2月上市的23款寡核苷酸药物，公开资料显示其中19款采用放射性核素进行ADME研究。本文将重点介绍siRNA与ASO药物的放射性标记合成策略及ADME研究关键考量。
寡核苷酸药物放射性标记合成策略
寡核苷酸药物的放射性标记合成涉及核素选择、标记位点和标记个数，需综合考虑给药剂量、代谢稳定性及合成路线等因素，以满足放射性ADME实验需求。目前主要使用的核素为14C、3H和35S[3]，通过同位素替代（12C/1H/32S）后一般不会改变分子原有药代动力学行为。三种核素各有特点，35S半衰期短（87.5天）；14C和3H为长半衰期核素（分别为5730年和12.3年），因此研究者更倾向于使用14C和3H。3H比活度高（28.6 Ci/mmol），但存在氢氚交换风险，可能导致标记丢失，从而影响代谢和排泄研究的准确性；14C稳定性高，但比活度较低（62.4 mCi/mmol），对于大分子或低剂量药物，单个14C标记可能无法满足放射性物质平衡和代谢物谱研究的定量需求。
上市药物放射性标记核素的选择
我们对8款siRNA和15款ASO药物（含1款EMA批准）的放射性物质平衡和组织分布信息进行了汇总（见附表A）。结果显示放射性核素的选择与给药剂量密切相关：给药剂量较高的药物倾向于使用14C标记，剂量较低的则多选用比活度更高的3H。除了与给药剂量相关外，放射性核素的选择也受到标记化学可实现性的制约。
siRNA药物
与化学小分子药物通常使用14C标记不同，siRNA药物可能应用14C或3H标记。在8款siRNA药物中，分别有3款采用3H或14C标记进行体内ADME研究。其中，14C标记的Lumasiran和Inclisiran在物质平衡研究中的给药剂量分别为10 mg/kg和20 mg/kg；而3H标记的Vutrisiran和Nedosiran的剂量为3 mg/kg和5 mg/kg。
ASO药物
15款上市ASO中，分别应用3H或14C标记的各为5款；值得注意的是，5款应用14C标记的ASO中，有4款属于PMO，另1款为1998年上市的Fomivirsen，表明PMO更倾向于使用14C标记，而PS-ASO则多采用3H标记。此外Defibrotide、Tofersen和Imetelstat分别使用125I、99mTc和35S标记研究大鼠或人体中的组织分布和排泄。采用3H标记的PS-ASO类药物，如Mipomersen、Inotersen和Volanesorsen，给药剂量均为5 mg/kg；Donidalorsen的给药剂量更低，为2 mg/kg。
未开展放射性ADME研究的寡核苷酸药物
部分药物如siRNA药物Fitusiran（Sanofi/Alnylam，2025年上市）、Plozasiran（Arrowhead，2025年上市），及ASO药物Nusinersen（Biogen/Ionis，2016年上市）、Olezarsen（Ionis，2024年上市）的公开资料中并未查找到开展放射性ADME研究的相关信息，可能因为这些药物基于已验证平台（Alnylam公司的GalNAc-conjugated siRNAs平台、Arrowhead公司的Targeted RNAi Molecule平台或Ionis公司的ASO平台）开发，其平台ADME特征已充分明确[2]。根据白皮书建议，同一平台后续分子的排泄研究并非必需[2]。
放射性标记位点的选择
与小分子药物相比，寡核苷酸药物的放射性标记位点选择更为复杂[1]。若标记在核酸序列末端，放射性核素可能在体内代谢过程中被去除，影响结果准确性。因此，标记位点需结合前期代谢产物鉴定数据，尽量选择代谢稳定的区域。
ASO药物
14C优先标记在具有核酸酶抗性的修饰核苷酸上，如含有2'-F或2'-OMe修饰的碱基的2号位，或核糖的2'位点（如2'-MOE），这些区域代谢稳定性高，可满足放射性的有效示踪。3H则常标记在核糖5'位亚甲基上，也可标记在嘌呤碱基的2号位或8号位。
siRNA药物
通常标记在反义链上，先合成放射性标记的反义链，再与未标记的正义链退火形成双链siRNA（见图1）。
第二代ASO药物通常采用“缺口”设计：中间10个核酸单体区域（即gap区域）的核糖2’位置经脱氧修饰，而分别位于两端区域（即wing区域）的5个核酸单体，其核糖2’位置经2'-MOE修饰。Ionis公司的研究显示，标记位置的选择可能影响标记后ASO分子的稳定性。当3H标记在gap区域时，易发生氚水交换；而标记在wing区域时，氚水交换显著减少[9]。这可能是由于wing区域的2'-MOE修饰使核糖结构更加稳定，从而降低了氢氚交换的发生率。不同标记位点在分子稳定性、合成难度上差异显著，需根据具体研究目标权衡选择。药明康德DMPK已在该领域积累丰富经验，依托寡核苷酸合成与放射性检测技术平台，成功合成了14C标记的ASO、siRNA及AOC药物，并具备3H标记能力，可支持各类寡核苷酸药物的放射性ADME研究。
图1. ASO和siRNA药物的放射性标记位点
寡核苷酸药物放射性ADME研究关键考量
寡核苷酸药物的体内ADME研究目的、设计原则与数据分析思路与小分子药物相似[2]。然而，该类药物的长半衰期、强电负性及多样化化学修饰（如PS骨架、2'-F、2'-MOE等）的特征，以及部分分子较长的组织驻留时间，给物质平衡样本的收集、组织分布时间点选择和代谢产物鉴定带来了新的挑战。
物质平衡
GalNAc-siRNA主要经肝脏代谢和肾脏清除，PS-ASO则以完整分子和核酸酶剪切后的代谢物形式经尿液排出。与小分子药物研究不同（排泄物的总放射性回收率通常要求达到90%以上），寡核苷酸药物回收率普遍偏低。我们对7款已上市PS-ASO的物质平衡研究结果进行了汇总（见表1），发现除35S-Imetelstat外，其余6款ASO的排泄回收率均小于80%。采用3H标记的5款ASO，即使计入尸体组织残留，总回收率也普遍低于90%。可能原因包括氢氚交换导致的放射性损失，或后期样品浓度接近检测下限造成的实验偏差。
表1. 7款上市ASO药物的物质平衡研究结果
标记核素 | 14C | 3H | 35S | ||||||
ASO | Fomivirsen | Mipomersen | Inotersen | Volanesorsen | Eplontersen | Donidalorsen | Imetelstat | ||
种属 | 兔 | 大鼠 | |||||||
给药量 | 8.43 µCi/0.66 mg/mL | 5 mg/kg | 5 mg/100 µCi/kg | 5 mg/kg | NA | 2 mg/200 µCi/kg | 1 mg/kg | 5 mg/kg | |
收集 时间 | 20天 | 14天 | 56天 | 56天 | 56天 | 56天 | 7天 | ||
尿液 | 16.7% | 26.3% | 45.2% | 48% | 59.4% | 17.14% | 81.6% | 61.66% | |
粪便 | 3.2% | 4.2% | 11.5% | 7.67% | NA | 57.46% | 17.95% | 20.83% | |
笼具冲洗液 | NA | 0.99% | 1.41% | 1.98% | NA | 2.16% | 1.05% | 0.89% | |
胃肠道内容物 | NA | 0.44% | NA | NA | NA | NA | NA | NA | |
尸体 | NA | ~51% | 21% | 19.1% | NA | 5.84% | 0.52% | 0.69% | |
排泄 回收率 | 19.9% | ~32% | 58.11% | 57.65% | NA | 76.8% | 100.6% | 83.38% | |
总回 收率 | NA | ~83% | ~80% | ~77% | 89% | 82.6% | 111.9% | 96.9% | |
备注：表中数据以占放射性给药量的百分比表示。排泄回收率为尿液、粪便和笼具冲洗液的放射性回收率之和，总回收率为排泄回收率、尸体和其它（如胃肠道内容物）的放射性回收率总和。
与PS-ASO相比，PMO药物对核酸酶更稳定，血浆蛋白结合率低、排泄速度快、回收率更高。例如14C-Viltolarsen (20 mg/kg），7天排泄回收率达99.0%，与小分子药物相似。
鉴于PS-ASO和siRNA排泄缓慢，研究设计需考虑延长排泄物的收集时间，必要时检测动物尸体中的放射性残留量[1]。此外，排泄样本收集期间可根据测定结果动态调整样品收集间隔。
组织分布
放射性标记技术，尤其是定量全身自显影（QWBA），可直观呈现药物全身分布情况及体内动态变化。从已上市药物来看，除Fomivirsen（1998年上市）采用传统摘取组织法外，其余采用14C/3H标记的寡核苷酸药物均采用QWBA研究组织分布。
siRNA药物：一般以肝脏分布为主，肾脏、淋巴结等血流丰富的组织中也有较高水平分布；
ASO药物：主要分布在肝脏、肾脏及淋巴结，分布特征与siRNA类似。
以在研的ASO药物Renadirsen（治疗杜氏肌营养不良症）为例，该药物经14C标记后开展了小鼠的QWBA研究[5]。给药后0.5 h的放射性图谱显示（见图2a），放射性广泛分布于大部分组织，其中肾脏放射性浓度最高，膀胱次之。给药后336 h图谱显示（见图2b），肝脏、心脏和膈肌中仍维持高浓度的放射性，表明Renadirsen在靶组织（膈肌等肌肉组织）中具有长期滞留和分布的特性。在小分子药物的QWBA研究中，通常选择5-8个时间点，即可较好地描绘药物的全身消除规律。然而，寡核苷酸药物因其长半衰期的特性，需设置更长的采样点。
图2. 小鼠单次皮下注射14C-Renadirsen（10 mg/kg）的QWBA图谱(a和b分别代表给药后0.5 h和336 h)
代谢
小分子药物一般经CYP450酶等Ⅰ相和Ⅱ相酶代谢，而寡核苷酸主要经核酸外切酶和核酸内切酶水解代谢。此外，寡核苷酸药物代谢的种属差异较小，因此人体中发现的代谢产物在动物种属中不存在，或在动物中水平远低于人体水平的可能性较低，但仍不能忽视代谢产物的安全性评价。
以GalNAc-siRNA为例，其主要代谢途径为：AS链的3’端脱去一个核苷酸形成主要代谢物AS（N-1）3'，SS链主要代谢途径为脱去1-3个GalNAc分子。由于放射性核素通常标记在核酸链上，因此无法追踪脱落的GalNAc与核酸链之间linker的代谢途径。有研究在linker上标记3H，成功追踪到胆汁和粪便中linker分支臂的氧化代谢物和linker环化代谢物[3][10]。
案例分享：siRNA药物Lumasiran的ADME研究[4]
排泄：在完整大鼠中，粪便是14C标记Lumasiran的主要排泄途径；而在食蟹猴中，尿液为主要排泄途径，表明siRNA药物在不同种属间的排泄途径差异可能较大（见表2）。此外，胆管插管大鼠实验显示，胆汁排泄也是重要清除途径。无论在大鼠还是食蟹猴中，粪便和尿液的总放射性回收率均低于55%，这可能与Lumasiran的半衰期较长及其在组织中的长期滞留有关。值得注意的是，两项大鼠研究中包含尸体的放射性总回收率均低于80%。
表2. 单次皮下注射14C-Lumasiran后的放射性回收率
种属 | 完整大鼠 | 胆管插管大鼠 | 猴 |
给药量 | 10 mg/kg | ||
采集时间 | 56天 | 7天 | 90天 |
性别 | 雄性 | ||
尿液 | 19.5±1.34% | 15.3±2.43% | ~38% |
粪便 | 33.9±0.69% | 0.67±0.29% | ~8% |
胆汁 | NA | 28.3±6.52% | NA |
尸体 | 8.88±1.10% | 34.0±6.06% | NA |
笼具冲洗液 | 1.09±0.38% | 0.67±0.29% | ~9% |
总回收率 | 63.4±1.32% | 78.9±1.73% | 54.6±8.12% |
备注：表中数据以占放射性给药量的百分比表示。总回收率为排泄回收率、尸体和其它（如笼具残留）的放射性回收率总和。
组织分布：大鼠QWBA结果显示，给药部位暴露量最高，其次为肝脏和肾脏；肾上腺、心脏等其他组织浓度较低，中枢神经系统（CNS）中的暴露量可忽略不计，这与siRNA的靶向设计特征相符。
代谢：在猴肝脏中检测到Lumasiran的脱氨代谢物（AS链3’端腺苷转化为肌苷），表明寡核苷酸除了可被核酸酶水解外，还可发生脱氨代谢。
结语
基于对23款上市药物的数据解读与多年项目实践，药明康德DMPK总结出以下经验，助力高效推进寡核苷酸药物的研发：
放射性标记合成：根据给药剂量等因素选择合适的标记核素（14C或3H），并结合前期代谢产物鉴定数据及合成路线，将放射性同位素标记在经修饰且代谢稳定的核酸单体上。
放射性ADME研究：物质平衡研究中，需延长排泄物收集时间，并动态调整样品收集间隔；组织分布研究中可使用QWBA技术，并设置更多的采样点，以充分表征药物在组织中的长半衰期特性；代谢研究中，对于创新型的寡核苷酸药物，如含新型linker，可将核素标记在linker上，以更好追踪linker相关代谢物。
随着寡核苷酸分子设计和递送技术的不断突破，其治疗适应症正逐步向肝外拓展，这对寡核苷酸药物的ADME研究提出了更高要求。 药明康德DMPK拥有超十年放射性项目研究经验，积累了数百次放射性受试物NMPA/FDA申报的成功经验，并具备完善的放射性标记合成、物质平衡、组织分布、代谢物谱及代谢产物鉴定等技术平台，始终致力于以高效、精准的ADME研究，助力客户加速寡核苷酸药物研发进程。
附表A. FDA及EMA批准的寡核苷酸药物汇总[6][7][8]
siRNA /ASO | 递送系统 /结构类型 | 活性成分及给药方式 | 上市时间(年) | 盐型分子 量(Da) | 体内ADME研究类型，核素，种属 及给药剂量（如有） |
siRNA
| LNP | Patisiran IV | 2018 | 14304 | QWBA, 14C, Rat: 0.3 mg/kg. TD, 14C, Monkey. MB, 14C, Rat&Monkey. |
GalNAc | Givosiran SC | 2019 | 17246 | QWBA, 3H, Intact Rat: 10 mg/kg. MB, 3H, Intact Rat /BDC Rat: 10 mg/kg. | |
GalNAc | Lumasiran SC | 2020 | 17286 | QWBA, 14C, Rat: 10 mg/kg. MB, 14C, Rat&Monkey: 10 mg/kg. | |
GalNAc | Inclisiran SC | 2020 | 17285 | QWBA, 14C, Rat&Monkey: 65 mg/kg&20 mg/~54 uCi/kg. MB, 14C, Rat. MB, 14C, Monkey: 20 mg/~54 uCi/kg. | |
GalNAc | Vutrisiran SC | 2022 | 17290 | QWBA, 3H, Rat: 3 mg/kg. MB, 3H, Rat: 3 mg/kg. | |
GalNAc | Nedosiran SC | 2023 | 22238 | TD, 3H, Mouse: 5 mg/kg. | |
GalNAc | Fitusiran SC | 2025 | 17193 | NA | |
GalNAc | Plozasiran SC | 2025 | 16564 | NA | |
ASO
| PS-ASO | Fomivirsen IVT | 1998 | 7122 | Traditional TD, 14C, Rabbit: 8.43 uCi/0.66 mg/mL. Traditional TD (eye tissue), 14C, Monkey: 11.3 uCi/ mg. MB, 14C, Rabbit: 8.43 uCi/0.66 mg/mL. |
PS-ASO | Mipomersen SC | 2013 | 7595 | QWBA, 3H, Rat: 24 mg/1009 uCi/kg. MB, 3H, Rat: 5 mg/kg. | |
PO-ASO* | Defibrotide IV | 2016 | 13-20 kDa | TD&MB, 125I, Rat: 6.25 mg/kg&12.5 mg/kg& 25 mg/kg. | |
PS-ASO | Nusinersen IT | 2016 | 7501 | NA | |
PMO | Eteplirsen IV | 2016 | 10306# | QWBA, 14C, Mouse：120 mg/300 uCi/kg. MB, 14C, Mouse：120 mg/300 uCi/kg. | |
PS-ASO | Inotersen SC | 2018 | 7601 | QWBA, 3H, Rat: 25 mg/500 uCi/kg. Traditional TD, 3H, Rat: 5 mg/100 uCi/kg. MB, 3H, Rat: 5 mg/100 uCi/kg. | |
PS-ASO | Volanesorsen SC | 2019 | 7583 | QWBA, 3H, Rat: 5 mg/kg & 25 mg/kg. MB, 3H, Rat: 5 mg/kg & 25 mg/kg. | |
PMO | Golodirsen IV | 2019 | 8647# | QWBA, 14C, Mouse: 120 mg/300 uCi/kg. MB, 14C, Mouse: 120 mg/300 uCi/kg. | |
PMO | Viltolarsen IV | 2020 | 6925# | TD, 14C, Rat&Monkey: 20 mg/kg. MB, 14C, Rat&Monkey: 20 mg/kg. | |
PMO | Casimersen IV | 2021 | 7585# | QWBA, 14C, Mouse: 120 mg/300 uCi/kg. MB, 14C, Mouse: 120 mg/300 uCi/kg. MB, 14C, Huamn: ~100 uCi/1800 mg per person. | |
PS-ASO | Tofersen IT | 2023 | 7128# | TD, 99mTc, Human: SPECT/CT. | |
PS-ASO | Eplontersen SC | 2023 | 9046 | QWBA&MB, 3H labeled on nucleic acid strand, Rat. QWBA&MB, 3H labeled on linker THA, Rat. | |
PS-ASO | Olezarsen SC | 2024 | 9124 | NA | |
PS-ASO | Imetelstat IV | 2024 | 4896 | TD, 35S, Rat: 1 mg/kg & 5 mg/kg. MB, 35S, Rat: 1 mg/kg & 5 mg/kg. | |
PS-ASO | Donidalorsen SC | 2025 | 9112 | QWBA&MB, 3H, Rat: 10 mg/500 uCi/kg. Traditional TD&MB, 3H, Rat: 2 mg/200 uCi/kg. |
备注：#：游离型分子量；NA：未在公开资料中查找到放射性ADME研究的相关信息；MB：物质平衡; TD：组织分布; Traditional TD：组织摘取法开展组织分布研究; IVT：玻璃体内注射; IT：鞘内注射；IV：静脉注射; SC：皮下注射; *：Defibrotide为磷酸二酯键的ASO混合物; Volanesorsen于2019年获得EMA批准。
作者：丁亚、张亚峰、吴江林、郭莲、张玲玲
编辑：富罗娜·克里木、钱卉娟
设计：张莹莹
药明康德DMPK依托中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1700家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过2100个新药临床研究申请（IND）。
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参考
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[2] Berman C L, Antonsson M, Batkai S, et al. OSWG Recommended Approaches to the Nonclinical Pharmacokinetic (Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion) Characterization of Therapeutic Oligonucleotides[J]. Nucleic Acid Therapeutics, 2023.
[3] Edelmann M R. Radiolabeling small and biomolecules for tracking and monitoring[J]. RSC advances, 2022, 12(50): 32383-32400.
[4] http://www.ema.europa.eu/en/medicines/human/EPAR/oxlumo#assessment-history
[5] Ito K, Takakusa H, Kakuta M, et al. Renadirsen, a novel 2′ omerna/ena® chimera antisense oligonucleotide, induces robust exon 45 skipping for dystrophin in vivo[J]. Current Issues in Molecular Biology, 2021, 43(3): 1267-1281.
[6] Hammond S M, Aartsma‐Rus A, Alves S, et al. Delivery of oligonucleotide‐based therapeutics: challenges and opportunities[J]. EMBO molecular medicine, 2021, 13(4): EMMM202013243.
[7] Vinjamuri B P, Pan J, Peng P. A review on commercial oligonucleotide drug products[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2024, 113(7): 1749-1768.
[8] Cronin J M, Yu A M. Small RNA or oligonucleotide drugs and challenges in evaluating drug-drug interactions[J]. Frontiers in Pharmacology, 2025, 16: 1720361.
[9] Post N, Yu R, Greenlee S, et al. Metabolism and disposition of volanesorsen, a 2′-O-(2 methoxyethyl) antisense oligonucleotide, across species[J]. Drug metabolism and disposition, 2019, 47(10): 1164-1173.
[10] Shemesh C S, Rosie Z Y, Gaus H J, et al. Elucidation of the biotransformation pathways of a Galnac3-conjugated antisense oligonucleotide in rats and monkeys[J]. Molecular Therapy Nucleic Acids, 2016, 5.
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