药物分布和蛋白结合研究
血浆和其他组织成分中的游离分数是非常重要的参数，对于了解候选药物的许多重要特性非常关键，它们对构建IVIVE、预测药物相互作用、估计治疗指数以及建立PK/PD关系具有重要影响。
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药物与血浆蛋白的结合作用影响药物在体内的吸收、分布、代谢与排泄，从而影响药理效应强度和时间。药物进入人体，通常情况下只有游离的药物才能到达靶点发挥药理效应，因此测定药物与血浆的蛋白结合率在新药研发及临床研究中非常重要。药明康德DMPK可为客户提供平衡透析法（HTD和RED）、超速离心法、超滤法、通量透析法、竞争透析法、报告酶法(测定动态蛋白结合)等多种方法进行血浆、组织、肝细胞、肝微粒体等多种基质的蛋白结合实验，同时也可提供全血血浆分配比及溶血实验。药明康德DMPK实验室可测试多种性质的化合物，如不稳定的、高度结合的化合物、共价抑制剂、多肽、PROTACs*（Proteolysis-Targeting Chimeras）、siRNA、ASOs等。
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稀释法测定PPB -
多肽化合物在人血浆中的游离率
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图 1. 通量透析得到的游离分数与文献报道的数据进行比较的bland-Altman图
当化合物的血浆蛋白结合率非常高时，通常采用稀释法测定PPB。由于血浆稀释后可能导致血浆蛋白饱和，建议在研发使用未稀释血浆的其他方法对游离分数进行验证。通量透析是一种推荐的方法，我们实验室通过验证添加了商业化标准品的血浆与空白血浆进行透析的初始通量率来测定游离分数。它可以测量极低的游离分数而不受非特异性结合等问题的影响。左图描述了实验室内部通量透析和文献报道的游离分数进行对比的Bland-Altman图。
图1. 通量透析得到的游离分数与文献报道的数据进行比较的bland-Altman图，用于确定两种测试方法是否一致。上下短划线是差异的95%置信区间的上限和下限。上下虚线是差异平均值的95%置信区间的上限和下限。如果差异平均值95%置信区间包含零，则认为两种方法得到的测试数据一致。
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当化合物为多肽时，由于多肽的分子量通常较大，不易透过透析膜且容易产生非特异性吸附，建议在研发时采用超速离心法进行实验。我们实验室选择了已上市的10个多肽商品药物作为测试化合物，采用超速离心法评估化合物与人血浆结合的实验验证，得到药物在人血浆中的游离率，实验结果与文献值较为接近（见表1）。
表1 超速离心法测定的多肽化合物在人血浆中的未结合率与文献值
药物名称
%Unbound（内部数据）
%Unbound （文献值）
西曲瑞克
14.0
14.0
环孢素
6.8
6.8
达托霉素
6.7
8.3
地加瑞克
17.4
10.0
依替巴肽
66.0
75.0
艾替班特
46.5
56.0
亮丙瑞林
33.3
20.0
奥曲肽
51.1
35.0
利拉鲁肽
0.40
0.51
利西拉肽
36.9
45.0
经验
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10+
年
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40K+
化合物*种属测试/年
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≤ 5
TAT≤5天
常见问答
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是否有必要测试多个浓度的血浆蛋白结合?
在药物发现阶段，当使用100%的血浆进行蛋白结合率测试时，通常以标准浓度(1~2 μM)进行测定。血浆蛋白不易出现饱和。然而由于存在血浆蛋白蛋白被饱和的案例，当化合物的体内血浆浓度较高，高于体内可用结合位点的数量时，以及当与结合蛋白的亲和力很高时，有必要评估浓度依赖性并确定主要的血浆结合蛋白。
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了解药物是否与酸性糖蛋白高度结合有什么重要意义?
AAG是主要的血浆结合蛋白之一，具有高亲和力、低容量的特点。在蛋白表达、同源性和药物结合亲和力方面存在明显的物种和年龄差异。因此，了解药物是否与AAG结合在构建从动物物种到人类，健康与患病人群，成人到儿童人群的PK/PD关系是非常重要的。
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是否有必要测定组织中的游离分数？最佳匀浆比是多少？
在血浆或组织中测得的总药物浓度，可能并不代表药理活性部位的药物浓度。因此，有必要开展组织结合实验以得到在组织中的游离药物暴露量。大多数筛选研究采用单一稀释法，如3倍至10倍的匀浆比，将稀释后的组织中测得的fu校正为未稀释的fu。在研发后期阶段，推荐使用多种稀释比例的匀浆，以利于为数据外推和确认组织匀浆中蛋白结合的线性特征提供更可靠的数据。
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如何测定不稳定化合物的PPB？
准确测定血浆中不稳定的化合物PPB是有一定难度的，因为不稳定会使测定结果的可靠性降低。目前已报道了几种测定不稳定化合物PPB的方法，如超滤法、抑制剂法、低温法、稀释法等。它们的适用性取决于药物开发的阶段、在血浆中不稳定的机理以及实验成本。
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为什么要测定体外孵育基质结合的非特异性结合？
在药物代谢和酶动力学实验中使用大量的细胞、亚细胞组分、组织或重组酶系统，化合物容易与其产生非特异性结合，影响游离药物的浓度，同时实验测得的表观动力学参数会偏离真实值，影响药物代谢中酶动力学研究评估的代谢率和抑制效力。因此需要测定体外孵育基质结合的非特异性结合，以对孵育基质中的游离浓度进行校正。
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为什么要进行BPR研究？
体外BPR实验是指平衡状态下全血总药物浓度与血浆总药物浓度之比，药物在红细胞中的高分配或低分配可能导致血液和血浆中的药物浓度有很大差异，因此了解药物在血浆和血细胞之间的分布对于正确解释药代动力学参数至关重要。然而，应该注意的是，体外实验测定的B/P比可能与体内情况不同。体内的BPR数值和研究药物在血浆和血液中的瞬时分布可能在体内PK-PD研究的期限内具有时间依赖性。因此，应当仔细考虑适当的体外和体内BPR研究设计，以准确地校正血液-血浆参数。
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