体外代谢产物鉴定研究

体外代谢产物鉴定研究具有简单、快速和高通量等特点，可用于研究候选化合物的生物转化途径，预测药物体内代谢情况；可为先导化合物优化、药物毒理实验及代谢酶表型研究提供依据。

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代谢产物鉴定

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体外代谢产物分析鉴定实验平台运用超高效液相色谱（UPLC）-紫外检测器（PDA）-高分辨质谱（HRMS）串联技术，可提供基于不同实验目的的3种常规体外实验类型，包括代谢软点分析、反应性代谢产物捕获和种属（代谢物谱）差异比较。同时还包括其它非常规实验类型和方法，如用于抗体药物偶联物（ADC）的酸化S9和溶酶体孵育体系，以及代谢产物匹配、H/D 交换实验和三氯化钛还原等代谢产物结构确认实验。

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实验

代谢软点分析
实验阶段
早期筛选

实验特点
样品孵育时间根据体外代谢半衰期调整（一般1-2 t_1/2）
单个或多个种属肝微粒体/肝细胞或其它孵育体系
LC-UV-HRMS分析
交付结果
2~3个主要初级代谢产物的结构及其代谢途径
反应性代谢产物捕获
实验阶段
筛选

实验特点
单个或多个种属肝微粒体+GSH/Cys孵育体系或者其他捕获试剂
LC-UV-HRMS分析
交付结果
GSH相关代谢产物或其他对应的反应性代谢产物的结构及其代谢途径
3.多种属代谢差异比较的代谢产物研究
实验阶段
筛选或IND

实验特点
多种孵育体系：肝微粒体、肝S9、肝细胞、全血或血浆等
单种属或多个种属的代谢物谱和主要代谢产物鉴定研究
LC-UV-HRMS分析
交付结果
主要代谢产物的结构及其代谢途径
其它非常规实验类型

特殊供试品类型及其代谢体系：
针对特殊供试品类型例，如多肽、ADC、PDC、寡核苷酸等需求提供非常规实验体系；酸化S9、溶酶体、肿瘤细胞等孵育体系

特殊实验目的：
进一步明确代谢产物结构；化合物结构的衍生化、H/D交换和TiCl₃还原反应等研究

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案例分享

市售化合物A在大鼠、犬、猴和人肝细胞孵育体系中的代谢产物分析和鉴定

化合物A（10 μM）在大鼠、犬、猴和人体外肝细胞孵育中孵育120分钟，孵育后的样品进行LC-UV-MS分析，化合物A及其代谢产物在样品中的LC-UV（λ: 270-360 nm）色谱图和相对丰度结果分别见图1、表1。化合物A在肝细胞中主要生成了8个代谢产物（M1-M8）。与动物种属比较，化合物A在人肝细胞中检测到的代谢产物至少可在两个动物种属中被检测到。在人肝细胞中，M1、M6和M8是相对丰度较高的三个主要代谢产物，其中M6在动物种属中占比均小于1%，可能是由于M6进一步与葡萄糖醛酸发生了结合。综合比较各种属数据，化合物A在人肝细胞中的代谢物谱与犬肝细胞接近，从体外代谢相似性考虑，提示犬可以作为化合物A在后期毒理学评价研究的大动物实验种属。

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- 化合物A在大鼠、犬、猴和人体外肝细胞样品的代谢物谱图（LC-UV）
  
  图1
- 化合物A在大鼠、犬、猴和人体外肝细胞样品中的代谢产物及其相对丰度
  
  表1

经验

16+

年服务经验
500+

IND申报项目
8000+

筛选项目

仪器与软件

仪器设备
配套软件

- Thermo Orbitrap Eclipse™ Tribrid™
- Thermo Orbitrap Exploris™ 480
- Thermo Q-Exactive™ HF
- Waters VION™ IMS QTof
- Thermo Q-Exactive™ Plus
- Thermo Q-Exactive™
- Therno LTQ Orbitrap XL
- Waters Xevo®G2 QTof
- 固体闪烁计数仪：用于离线放射性检测
- 液体闪烁计数仪：用于总放射性检测
- 在线放射性检测
- Thermo Scientific™ Compound Discoverer™
- Thermo Scientific™ Mass Frontier™
- Thermo Scientific™ Metworks™
- Waters MetaboLynx^TM
- Mass Analytical Mass-MetaSite
- Waters UNIFI^®
- Thermo Scientific™ Biopharma Finder™

常见问答

体外MetID试验是如何开展的？

首先根据实验目的选取合适的体外代谢体系（如微粒体、细胞和血浆等）和孵育条件（如孵育时间，底物浓度和酶浓度）进行孵育，孵育后的样品经合适的前处理提取方法如蛋白沉淀、液液萃取或固相萃取等处理后，采用LC-UV-HRMS进行分析。然后与空白对照样品进行比对，依据测试样品中检测到的各代谢产物的一级和二级质谱信号以及测试化合物的质谱碎裂行为，结合多种数据处理软件、技术及研究人员的专业判断，来分析测试化合物的代谢物谱、代谢产物的可能结构和代谢途径。
开展体外MetID试验时，采取哪些分析检测技术？

体外代谢产物分析鉴定主要采用超高效液相色谱（UPLC）-紫外检测器（PDA）-高分辨质谱（Q-TOF/Orbitrap）串联技术进行数据采集，再结合数据处理软件（如Xcalibur，Compound Discoverer，Masslynx，mass metasite等）和多种数据处理技术（如质量亏损过滤、背景扣除、特征离子提取和同位素过滤等）来发现和鉴定代谢产物。
在开展体外MetID试验时，如何设置孵育时间？

开展体外MetID试验时，根据实验目以及供试品在孵育基质中的体外稳定性数据来调整其孵育时间及合适的实验体系。例如，开展代谢软点分析试验时，孵育时间不建议太长，建议为一般为1-2个半衰期。慢代谢化合物的肝细胞代谢产物鉴定适合选用贴壁细胞或者relay方法研究。
基于体外MetID试验结果，哪些代谢产物需要重点关注？

仅在人种属中出现或在人种属比例显著高于其他种属的代谢产物或有潜在毒性的代谢产物（如酰基葡萄糖醛酸产物）需要重点关注。