抗体偶联药物（ADC）在体外血液基质中的稳定性研究

抗体偶联药物（Antibody drug conjugate, ADC）由单克隆抗体（mAb）、载荷小分子（payload）和连接子（linker）三部分组成^[1]，其可通过抗体靶向肿瘤细胞表面抗原，将细胞毒素精准高效地递送到肿瘤部位，同时避开正常组织，具有高特异性靶向能力和强效的杀伤作用，已成为当前抗肿瘤药物研发的热点^[2]。

ADC药物在血液循环中应保持良好的稳定性，避免因载荷过早释放引起全身毒性和不良反应^[2]。而影响ADC药物血液循环稳定性的因素较为复杂，包括连接子^[3]、偶联方式^[4]、载荷小分子的理化性质^[5]、DAR值^[6]等。采用血液基质在体外评估ADC的稳定性，是比较简单且直接的评价方式。2023年9月，中国国家药监局药审中心（NMPA）发布《抗体偶联药物非临床研究技术指导原则》^[7]。该指导原则指出"临床试验开展前，需在人和动物（药理试验和/或毒理试验动物）的血浆和/或全血等介质中考察ADC的体外稳定性。在进行此项研究时需根据ADC的裂解释放特征，选择合适的检测目标，如检测ADC的变化和/或游离小分子化合物的生成情况。"

本文对各种体外孵育体系和稳定性结果进行介绍，并对已获批准上市的ADC药物体外血浆/血清稳定性研究进行了汇总，以期为ADC药物研发过程中的体外稳定性评价提供参考。

图1. ADC药物的结构和功能^[1]

ADC体外血浆稳定性

血浆是评价ADC药物体外稳定性最常用的基质。众所周知，血浆为血液和抗凝剂混合后离心去除细胞所得，存在多种水解酶^[8]。血浆具有制备简单快捷、得率高、方便冷冻储存和运输等诸多优点，已被广泛用于各种临床前临床研究。值得一提的是，用于体外稳定性研究的血浆，其抗凝剂的选择需要注意。常用于抗凝的EDTA为蛋白酶和核酸酶的抑制剂，采用EDTA制备的血浆，可能影响对蛋白酶很敏感的ADC血浆稳定性。为模拟体内稳定性，ADC的血浆孵育通常在37℃下进行，并在不同的时间点测定ADC的变化和/或游离小分子载荷的生成情况。孵育时间一般较长，通常为4~21天不等，孵育过程应避免染菌。种属应包括人和预期的药理学和毒理学种属，孵育浓度建议为体内预期达到的Cmax附近^[9]。此外，一般会设置含有蛋白（如BSA）的PBS缓冲液对照组来确定在无酶的缓冲液体系中ADC的稳定性^[10]。

目前，已有多种ADC药物的体外血浆稳定性数据和体内结果很好地转化。Enhertu（DS8201a）的血浆稳定性研究，在第21天检测到DXd在小鼠、大鼠、猴和人血浆中的释放率为1.2%至3.9%，表明其在血浆中是稳定的^[11]。上市ADC药物Polivy血浆稳定性研究，发现在血浆中孵育一段时间后，总抗浓度在24 h内明显降低，24 h后下降较为缓慢；孵育96 h，结合型payload浓度下降到60%左右。两组数据对比可以看出，抗体本身的不稳定也可导致Polivy的不稳定^[12]。

图2. DS-8201a的体外血浆稳定性^[11]

图3. Polivy的体外血浆稳定性，检测总抗（A）和结合型payload（B）的浓度^[12]

Han等^[13]发现马来酰亚胺偶联的ADC药物Tras-mcVC-Auristatin在血浆中孵育144小时后，通过LC-MS检测游离payload和DAR值得到的稳定性结果存在明显差异。DAR的变化表明ADC失去了30~50%的payload，而血浆中测得的游离payload浓度极低。同时两种方法得到的种属差异结果也不相同。进一步的研究表明，马来酰亚胺linker-payload转移至血清白蛋白形成加合物，引起DAR值降低。但是这部分payload不是以游离payload形式存在，也说明仅检测游离payload生成评估ADC的稳定性存在一定的风险。

图4. ADC药物Tras-mcVC-Auristatin的linker-payload结构（A）；体外血浆孵育过程中平均DAR值（B）和游离payload浓度（C）随时间的变化；（D）ADC中马来酰亚胺linker-payload转移的示意图^[13]

有文献指出，血浆的冷冻会降低连接子-载荷降解相关酶的活性^[14]，因此采用冷冻血浆研究需注意。也有文献报道体内外稳定性差异，如Dorywalska等发现VC-PABC连接子在小鼠体内的切割比在体外血浆中更加明显，推测是因为体内有连续的酶源或是由细胞内降解作用的贡献^[15]。

ADC体外血清稳定性

血清是血液完全凝固后离心得到的透明液体，不含纤维原和抗凝剂，相较于血浆规避了抗凝剂可能引起的酶活抑制、蛋白结合和样品稳定性等方面的潜在风险^[8]。血清目前已成为ADC药物血液稳定性体外研究中的另一种常用基质。血清在孵育条件和实验设计方面与血浆类似，孵育温度、时间、浓度和种属选择可参考血浆。

Aidixi在人、大鼠和小鼠血清中孵育24 h、4℃和37℃条件下，检测MMAE的释放量。结果显示，小鼠血清中MMAE的释放量为4.3%，其他条件下均低于1%。即Aidixi在人血清中最为稳定，大鼠次之，在小鼠中MMAE释放量较多，存在一定的种属差异。总体而言，Aidixi表现出较好的血清稳定性^[16]。在Trodelvy血清代谢稳定性研究中，检测了人和猴血清中孵育120 h后游离SN-38的浓度。结果表明：Trodelvy在体外血清中释放SN-38的半衰期约为1天^[17]。

图5. Aidixi的体外血清稳定性^[16]

图6. Trodelvy的体外血清稳定性^[17]

ADC体外全血稳定性

全血包括血细胞和血浆的所有成分，在组成上与体内环境最为接近，已被纳为NMPA指导原则中关于ADC体外稳定性研究的推荐基质之一。与血浆和血清不同，全血不能进行-80℃低温冷冻，不方便储存和运输。全血稳定性实验需要使用新鲜的基质来进行。目前，关于ADC药物采用全血测定体外稳定性的报道相对较少。

Aimee等人使用多种TDC药物评估了全血和血浆体外稳定性数据在预测体内稳定性的准确性^[14]。结果表明，与未冷冻或冷冻小鼠血浆（R²分别为0.34和0.01）相比，全血（R²为0.87）与体内稳定性的相关性更高。进一步表明，ADC全血稳定性也能够预测其他临床前物种（如大鼠和食蟹猴）以及人体内稳定性。根据我们的研究经验，全血孵育24 h以上存在血细胞破裂的风险，对于需要体外孵育24 h以上的ADC药物，其适用性有待进一步评估。

图7. 13种TDC药物的体外冻存血浆（A）、未冻存血浆（B）和全血（C）稳定性和体内稳定性的相关性（24 h）^[14]

注：坐标轴表示相对于0小时的药物损失百分比。

ADC体外稳定性的检测目标选择

对于ADC的体外稳定性研究，在上述的案例中也可以看出，检测目标存在多种选择。下面就各种检测目标及特点进行总结和分析。

• 检测游离小分子化合物浓度

  检测不同时间点游离小分子化合物生成的量，以及比较生成的种属差异，来评价ADC的体外稳定性。但当游离小分子化合物本身在血液基质中不稳定或易与蛋白共价结合时难以检测或检测不全。此外，对于检测的灵敏度要求高，推荐定量分析。

• 检测ADC的药物浓度

  通过酶联免疫法（LBA）进行ADC药物浓度的检测时，ADC上的payload只要没有掉落完全，均被当做完整ADC的浓度进行检测，因此对于稳定性的评价不够敏感。且ADC的浓度检测，需要提前获得anti-payload 抗体，对于新型payload往往需要提前制备，不适用于早期的筛选评价。

• DAR值分析

  通过检测ADC的DAR值变化来评估ADC的稳定性。平均DAR值能比较敏感地展示ADC的稳定性问题，也有效避免因为游离payload不稳定或linker-payload共同解偶联等因素导致无法准确检测payload释放，是比较推荐的评价ADC稳定性的指标。

• 检测总抗的药物浓度变化

  主要用于评价抗体在血液基质的稳定性，通过比较结合型抗体和总抗的浓度差异，进一步分析ADC的不稳定性是由payload释放引起，还是抗体本身的不稳定引起。

• 检测结合型payload药物浓度

  即检测结合于ADC上的payload浓度，首先需要采用免疫捕获的方法纯化ADC，再对结合在ADC上的payload进行有效地水解，适用于可裂解型ADC的检测。将payload有效水解是分析前处理的一个难点，需要具体问题具体分析。

上市ADC药物体外稳定性试验总结

目前，全球已有22款ADC药物获批上市，多种ADC进行了体外稳定性的评估。大部分已上市ADC药物均使用血浆来研究其体外稳定性，并设置含BSA的缓冲液组。与常规小分子相比，ADC血浆稳定性试验孵育时间较长，1到21天不等，通过检测游离小分子化合物和（或）总抗浓度，来判断payload是否过早释放以及抗体本身的稳定性。在22款ADC药物中，仅Trodelvy和Aidixi使用了血清作为孵育基质。

表1. 上市ADC药物的体外稳定性实验设计汇总^[18-21]

备注：C：猴；M：小鼠；R：大鼠；H：人

结语

对于ADC药物的开发，除需要花费大量工作在设计和选择合适的单克隆抗体和细胞毒素上，还需设计合适的连接子并综合考虑各种因素对ADC的稳定性、毒性、PK特性和药效学的影响，从而实现细胞毒性药物在靶肿瘤细胞上的释放。通过体外考察ADC药物在血液基质中的稳定性，可以帮助评估ADC在循环系统中稳定性，评估脱靶风险以及种属差异。药明康德DMPK已经建立各种针对ADC血液基质稳定性考察的体系，也具备检测多种分析物的能力，可以帮助客户全面评价ADC的体外稳定性，助力客户ADC药物的早期评价。

作者：史新萌，王翔凌，金晶

编辑：钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹

药明康德DMPK依托中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1700家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过2100个新药临床研究申请（IND）。

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