抗体偶联药物（ADC）定量生物分析及自动化助力药代动力学评估

抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugates，ADC）是结合了单克隆抗体的高度靶向性和小分子毒素的强细胞毒性的新疗法，由于其精准而强大的作用机理，已成为抗肿瘤抗体药物开发研究的新热点和重要趋势^[1]。ADC药物能够有效地杀伤癌细胞，同时不伤害正常组织，从而提高抗癌治疗的治疗指数，被誉为“精确制导的魔法子弹”。ADC由三个部分组成 (图1)^[2]，包括靶向性的抗体部分、发挥最主要功能的小分子载荷以及连接两者的连接子。ADC中的单克隆抗体通过与肿瘤细胞上过度表达的靶抗原结合后，ADC被内化到肿瘤细胞中，由于溶酶体蛋白酶的存在，细胞毒性有效载荷（Payload）与抗体部分分离，细胞毒性载荷启动细胞损伤或凋亡以杀死癌细胞^[3]。如有效载荷可以扩散到细胞外基质，杀死邻近癌细胞，称之为旁观者效应（Bystander Effect），这进一步增强了ADC的功效。全面地了解ADC药物的药代动力学特征，对于ADC药物的设计和开发至关重要，本文将重点介绍ADC药物的药代动力学评估生物分析策略和ADC药物定量生物分析平台，为药物研发者提供思路。

图1. ADC药物的结构^[2]

ADC药物临床前DMPK研究策略

ADC药物和传统的抗体药物或小分子药物相比，具有结构复杂的特点，多种因素会影响其疗效，同时ADC药物体内动态过程多样，从分布、解偶联、代谢和消除评价ADC药物的暴露-功效和暴露-安全关系，对于药物设计和后续开发均至关重要^[4]。ADC药物在各种组织中的吸收、分布、代谢和排泄（Absorption，Distribution，Metabolism，Excretion，ADME）直接影响ADC的疗效和安全性，相比其他药物更为复杂，也更具挑战^[5]。ADC药物不仅需要分析大分子（总抗体及偶联抗体）还需要分析小分子（游离载荷及偶联载荷）成分，ADC药物DMPK研究策略（图2）包括体外稳定性和payload释放实验、体内PK/PD研究等等。药明康德DMPK可以根据客户项目的需求，提出个性化的ADC药物药代动力学研究策略和具体的实验方案，加速药物的研发和注册申报。

图2. ADC药物DMPK研究策略

ADC药物定量生物分析

评估总抗体（Total Antibody）、偶联抗体 (Conjugated Antibody)、游离载荷（Free Payload）和相关代谢物的定量生物分析贯穿ADC药物早期发现/筛选、临床前和临床的各个阶段。为了正确评估ADC药物的ADME特性，需要综合性的生物分析手段。

在ADC药物生物分析中，配体结合分析（Ligand Binding Assay，LBA）是最常用的生物分析方法。LBA作为大分子定量研究领域的“金标准”，具有高灵敏度和高通量等优势，常用于检测总抗体、偶联抗体。分析难点在于需要针对不同的种属和基质类型进行关键试剂优化，因此LBA方法开发周期长，同时无法提供ADC的结构信息和相关的生物转化信息。如若无法获得关键试剂，可以使用替代方法进行检测。随着质谱技术的不断发展，液相色谱-串联高分辨质谱(Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry，LC-HRMS) 技术正越来越多地被用于大分子表征和定量，作为替代方法，LC-HRMS主要用于总抗体和偶联抗体的测定，具有时间周期短，通用性好等优点。关于不同生物分析平台详细介绍，欢迎参考我们此前发布的文章：整合性生物分析在抗体偶联药物（ADC）DMPK研究中的应用。下文根据分析物种类的不同，分别介绍对应的定量生物分析方法。

游离载荷（Free Payload）LC-MS/MS定量分析

影响ADC毒性很大因素在于游离载荷，因为游离有效载荷可能介导非预期的脱靶毒性，因此监测游离载荷十分必要，这也成为ADC研究中非常重要的一部分。游离载荷在血浆中浓度非常低，对灵敏度提出了更大的挑战，我们使用灵敏度较高的AB 6500、AB 7500进行Free Payload的定量分析。图3为20 pg/mL MMAE在大鼠血浆样品中的LC-MS/MS色谱图，定量低限仍有下降空间，线性满足方法要求。游离载荷的LC-MS/MS定量分析经常应用于判断ADC药物储存过程中是否释放Free Payload、抗体和毒素的连接子血浆稳定性、毒素本身生物基质中稳定性、小分子PK和组织分布等实验中。

图3. 20 pg/mL MMAE大鼠血浆样品中的LC-MS/MS色谱图和标准曲线

总抗体（Total Antibody）和偶联位点分析

总抗体通常使用LBA平台进行分析。LBA分为特异性方法（Specific Method）或者通用性方法（Generic Method），通常会准备至少两套关键试剂，确保方法开发顺利完成。同时在方法开发中需要考察方法对于完整ADC药物和裸抗的信号响应是否符合一般药代动力学的规律，也应该通过桥接实验考察裸抗与ADC信号的一致性。关于LBA平台详细策略，欢迎参考我们此前发布的文章：基于LBA技术的抗体类药物临床前PK生物分析策略与路径。

总抗体分析也可以使用特征性肽段（Surrogate Peptide）方法进行测定，如图4所示，为了减少来自基质的干扰，使用免疫亲和磁珠对ADC进行富集，再经胰蛋白酶酶解后，生成特征多肽，利用LC-MS/MS进行定量分析。该方法灵敏度高，特异性强。目前项目组可以根据抗体序列利用软件进行特征肽段方法开发及质谱方法优化，同时利用肽图可以对偶联位点进行监测。目前该方法已经成功用于体内PK实验和体外血浆稳定性实验（如图5所示），方法的定量低限在ng级别同时线性符合方法学要求。

图4. Surrogate Peptide定量流程

图5. 不同种属特征肽段定量浓度-时间分布及定量低限和标准曲线图

偶联抗体（Conjugated ADC）分析

偶联抗体通常使用LBA平台进行分析，利用抗载荷抗体（Anti Payload Antibody）进行捕获，目前我们针对热门的载荷均有试剂备库，同时已经建立in house方法有MMAE、MMAF、DM1/DM4、SN-39和DXd等，满足快速分析的需求。

如果无法获得抗载荷抗体，可以使用替代方法来进行分析偶联抗体。LC-HRMS方法通过借助对ADC抗体部分具有特异性结合的抗体或抗原，从生物基质中将目标物捕获出来，如图6所示，LC-HRMS方法在完整（Intact）或亚基（Subunit）水平分析ADC药物，通过计算得出偶联抗体的值。

图6. 不同偶联方式ADC药物的LC-HRMS分析流程

DAR值分析

药物抗体比(Drug-Antibody-Ratio， DAR)表示每个ADC药物抗体部分偶联载荷的数量，DAR值随着药物代谢不断变化，是描述ADC药物安全性和有效性的重要参数。疏水相互作用色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）被认为是半胱氨酸偶联ADC药物DAR值分析的金标准^[6]，但该方法对ADC需求量大（20-50 μg）且需要样品中有较高的ADC浓度^[7]。近年来，LC-HRMS以其独特的优势，在Intact和Subunit水平分析ADC药物DAR值提供了一种可行的方法^[8]，与HIC-UV法相比，LC-HRMS法所需供试品更少，可以实现不同DAR值ADC的表征。关于DAR分析详细策略，欢迎参考我们此前发布的文章：基于高分辨质谱技术的完整蛋白定量定性一体化生物分析。

综上所述，测试不同的分析物需要选择不同的平台或方法，如表1所示，每种平台或方法都有其优势及其适用场景，针对客户不同需求，提出适合的实验方案。

表1.  ADC药物分析平台选择

自动化助力药代动力学评估

自动化-提升ADC免疫捕获效率和精度

从复杂的生物基质中提取目标ADC药物通常利用磁珠进行免疫亲和捕获，但是该方法关键控制点多、依赖人员经验，存在实验流程长、数据重现性差等缺点，目前药明康德药物代谢与动力学部Non-GLP生物分析团队采用微色谱（IMCSTIPS）与自动化结合，将免疫亲和捕获时间从手动8 h缩短到自动2 h，同时提升数据的精度和交付的质量。

如图7所示，我们利用通用型和特异性的捕获试剂，同时尝试了常规血清和IgG deplete血清分别进行自动化免疫捕获效率的测试，并利用LC-HRMS进行检测。从图7中可以看出，如利用特异性的捕获试剂在常规血清中捕获效率80%左右；如果使用IgG deplete血清和特异性的捕获试剂，捕获效率可达90%。

图7. 自动化-免疫亲和捕获效率图

团队开发并验证了自动化-免疫亲和捕获用于单抗类药物和ADC类药物的PK分析能力。以DS-8201为例，如图8所示，利用Biotinylated-Her2和IMCS进行免疫亲和捕获，线性范围在1-50 µg/mL呈现良好的线性回归。

图8. 大鼠基质中利用自动化-免疫亲和捕获DS-8201轻链和重链线性图

自动化数据捕捉-提升数据处理效率和精度

ADC在LC-HRMS产生的海量数据，手动收集数据时间长，且易错不准确，药明康德DMPK利用自编代码进行自动数据整理，降低数据收集的时间，从手动整理数据8 h降低至自动化5 min，提升数据抓取效率和准确度。

结语

ADC药物结构复杂，体内过程多样，ADC药物的稳定性、安全性和有效性需要多种生物学分析平台共同助力完成，以观察ADC的独特生物转化和获得丰富、准确的数据。随着更多创新的偶联策略、抗体支架和新型弹头被用于下一代ADC，生物分析技术的未来发展将需要解决这些日益复杂的问题。

药明康德DMPK具有丰富的ADC药物生物分析经验，已成功构建了ADC药物整合性生物分析平台（LBA、LC-MS/MS和LC-HRMS），开发和验证了多维度的生物分析方法可对ADC的药代动力学进行评价。生物分析用关键试剂备库充足，具有多种in house方法包，缩短方法开发周期，同时利用自动化提升ADC免疫捕获效率和精度、自动化数据捕捉以提升数据处理效率和精度；结合定量全身放射自显影（Quantitative Whole Body Autoradiography，QWBA）技术研究ADC药物组织分布并全面阐述ADC药物体内特征，为客户提供一体化、一站式的ADC生物分析服务。药明康德DMPK已经成功支持几十个ADC研发项目，其中IND申报的ADC项目数十项，可为客户定制化设计ADC药物药代动力学研究策略，助力快速推进ADC药物研发和注册申报进程。

作者：曲栗，李陟昱，邢丽丽

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹

药明康德DMPK依托中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1800个新药临床研究申请（IND）。

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