深度分享丨抗体偶联药物（ADC）的DAR值测定策略与难点

抗体偶联药物（ADC，Antibody-Drug Conjugate）在近几年进入爆发式增长的高速发展阶段。据不完全统计，近几年全球的ADC临床前/临床研发管线数量也逐年加速上升。

表1. 2018年-2025年全球部分ADC临床前/临床研发管线数

不同的抗体、连接子或有效载荷会影响ADC的药代动力学（PK）和毒理学（TK）的特性，同一个ADC上偶联载荷分布也可能会导致不同的PK和TK性质，因此DAR值（Drug-to-Antibody Ratio，药物与抗体的比率）分布的分析及DAR值变化检测对ADC的评估无论从药理药效，还是从药代动力学和安全性评价角度都是十分重要；可以帮助ADC的优化设计，以确保治疗的最佳效果并减少潜在的不良反应，这对于ADC药物研发、临床试验设计和治疗方案制定具有重要的指导意义。

药物载荷分布及平均DAR值的检测策略需考虑几个因素，包括偶联方式、连接子类型、有效载荷和分析场景（合成表征、药代动力学分析）。基于高分辨质谱技术的完整蛋白定量定性一体化生物分析 一文中主要以赖氨酸偶联的代表药物：TDM1（Kadyla）为例对ADC的DAR值分析进行了方法学阐述，因此本文承接前文，将以DS8201（Trastuzumab deruxtecan ，T-DXd, Enhertu）为例介绍半胱氨酸偶联ADC与赖氨酸偶联ADC在DAR值定性及半定量检测方法的差异，并通过分析DS8201在体外孵育和体内给药血浆中的DAR值变化，探讨DMPK研究中检测ADC的DAR值分布及变化的考量、难点与对策。

抗体偶联药物的常见偶联策略

抗体偶联药物（ADC）从偶联位点区分，主要包括赖氨酸偶联型、半胱氨酸偶联型、基因工程化非天然氨基酸偶联以及N糖基化偶联型^[1]ADC。通过下表汇总的药物结构可以看出，目前已上市的ADC药物中除去光免疫疗法的Cetuximab sarotalocan以及融合蛋白免疫毒素Lumoxiti以外，主要以Kadcyla （TDM-1）为代表的赖氨酸偶联型ADC（四种）和以Enhertu（DS8201）为代表的半胱氨酸偶联ADC（九种）。除了Enhertu之外，半胱氨酸偶联ADC还包括Seagen公司的基于MC连接子和MMAE载荷的Vedotin平台的系列药物（Adcetris, Padcev, Polivy, Tivdak）等。2019年至2022年期间，已获批上市ADC药物中，半胱氨酸偶联型ADC占比达到了90%。

表2. 截至2023年已上市ADC药物偶联方式汇总表

半胱氨酸偶联型ADC的结构特点

IgG1型抗体的有四对由半胱氨酸残基组成的链间二硫键，这些链间二硫键经化学还原得到8个游离巯基，化学还原后的游离巯基通过与连接子的化学反应（例如与马来酰亚胺等亲核反应底物进行迈克尔加成反应），将有效载荷-连接子偶联在该巯基所在的半胱氨酸残基上，因此是一种定点偶联。如图1所示，当采用饱和偶联时，最大可以获得DAR8的ADC。以下将通过经典药物DS8201的结构介绍，带大家更深入地了解半胱氨酸偶联型ADC药物的特点。

图1. 半胱氨酸偶联ADC的结构示意图

图2. DS8201结构图

DS8201^[2]以曲妥珠单抗作为抗体，喜树碱类似物DXd作为载荷，含有可酶解的GGFG四肽为连接子，通过单抗上的巯基与连接子上的马来酰亚胺基团加成，实现抗体与药物的偶联，平均DAR值为7-8。DS8201对连接子的优化，可以改善连接子的酶解稳定性，以减少有效载荷的非靶向性释放；也可以在高DAR值时，避免疏水性有效载荷聚集等理化性质劣势^[3]，从而充分发挥有效载荷释放量和定点偶联均一性的优势。

DS8201的成功为半胱氨酸定点偶联技术的ADC药物研发带来了更多的信心。根据公开资料^[4]，第一三共基于HER3靶点开发的patritumab deruxtecan（U3-1402）^[4a]和 Seagen 的SGN-CD228A^[4b]等多款ADC已处于不同的临床研究阶段，前者采用DS8201相同的GGFG连接子和Dxd载荷，后者采用葡萄糖醛酸连接子和MMAE载荷。其中，中国的包括恒瑞的SHR-A1811^[4c]，正大天晴的 23C2 HER2-2-DDDXD^[4d]等，都是半胱氨酸定点偶联型ADC。

应用高分辨质谱（HRMS）技术检测生物样品中ADC药物DAR值

高分辨质谱法是测定ADC药物DAR值的有效方式。在使用高分辨质谱检测生物样品中（如血清/血浆）ADC的DAR值前，需要先通过免疫捕获富集。如图3所示，免疫捕获法通常是使用链霉亲和素修饰的载体（如磁珠、萃取柱）与生物素标记的捕获蛋白形成复合物，与样品中的ADC待测物进行抗原抗体反应结合留在载体上，弃去溶液后，将载体进行洗脱得到纯化的ADC及抗体蛋白。

图3. 磁珠法免疫捕获生物样品中ADC的方法流程

不同DAR值的抗体有不同的分子量，完整蛋白或蛋白亚结构（轻链/重链）通过液相色谱分离后用高分辨质谱进行检测，可以获得样品中各成分的质荷比(m/z)，带不同电荷数量的蛋白在质谱中呈现价态-质荷比的分布（图4），需要再经软件处理得到不同成分的去卷积质谱（图5）。根据质量数定性不同组分的DAR，获得ADC药物的DAR值分布信息，再根据不同DAR值组分的质谱强度，归一化计算其平均DAR值。

图4. 液相色谱-高分辨质谱分析ADC的LC-MS图和质谱图

赖氨酸偶联型ADC通常直接检测完整蛋白分子量（图5(A)），而半胱氨酸偶联型ADC主要通过检测轻链/重链亚结构的质量分析DAR值（图5(B)）。

图5. ADC的去卷积质谱图和DAR值分布（A：赖氨酸偶联型ADC的完整蛋白质量；B：半胱氨酸偶联型ADC的轻链/重链亚结构的质量）

当所有链间二硫键都被还原和偶联（DAR8）时，半胱氨酸偶联型ADC的抗体由于不再有链间二硫键的存在，两条轻链与两条重链会在酸性流动相的反相色谱中呈现解离状态（图6(A)），在高分辨质谱中可以检测到的是偶联一个载荷的轻链（L1），和偶联三个载荷的重链（H3）。

而当采用不完全偶联进行合成时（如DAR4），只有部分二硫键还原成巯基并进行偶联，可能会有轻链‑重链、重链‑重链和轻链‑重链‑重链等多种链间二硫键组合形态，这种情况下质谱峰会变得非常复杂，影响DAR值计算，甚至无法计算出有效DAR值；另一方面，即使完全偶联方式下，高DAR值ADC仍然有可能发生连接子脱偶联，则裸露的巯基可能发生氧化重组成链间二硫键，也会导致有效DAR值计算困难。

针对以上情况的链间二硫键组合，可采用免疫捕获后可以增加一步还原的方式，确保链间二硫键打开（图6(B)），则检测对象简并为检测轻链的DAR=1（L1）和DAR =0 （L0）的两种形式以及重链的DAR=3（H3）、DAR=2（H2）、DAR=1 (H1)和DAR =0 （H0）四种形式。获得上述轻链和重链各自的质谱强度，分别归一化算出轻链和重链的各自的平均DAR值，最后相加可得ADC的总平均DAR值。

图6. 半胱氨酸偶联型ADC色谱解链（A）和还原（B）示意图

对于非定点偶联的赖氨酸偶联型ADC，偶联位点是抗体上分布的80-90个赖氨酸残基，而链间二硫键无变化。如果将这类ADC也进行二硫键还原，其轻链和重链的DAR值分布会更复杂，反而增加了数据处理的难度，因此选择非还原的完整蛋白。

案例分析：DS8201的DAR值分析

如图7所示，根据文献中DS8201（T-DXd）猴体内药代动力学^[5]结果，总抗和总ADC的半衰期大约在4天左右，0~14天的血药浓度大约从100 μg/mL降到10 μg/mL以下。从DMPK研究角度，体外血浆稳定性实验可以参考体内给药后C_max（100~200 μg/mL）进行孵育；而对于动物体内和临床样品的DAR值检测（DS8201临床给药剂量5.4mg/kg），需要满足近1 μg/mL级别的检测限，使分析更具有挑战性。

图7. 猴注射给药DS-8201后的体内药代动力学数据（0.1-8 mg/kg给药量；━:总ADC;┄:总抗;─:载荷DXd）^[5]

参考了文献数据，我们以3mg/kg Trastuzumab deruxtecan（T-DXd）的给药剂量对SD大鼠进行体内药代动力学实验，同时以100 μg/mL T-DXd孵育浓度在大鼠血浆中进行体外稳定性研究，所获得的体内外血浆样品通过亲和免疫捕获后进行酸洗脱，再经碱中和后加入还原剂，最终处理后的样品采用Waters Acquity I-Class液相串联Waters Vion Q-Tof质谱检测并使用Waters Unifi软件处理数据。

图8为经上述分析过程得到的T-DXd在不同时间点血浆样品中的去卷积质谱图，T-DXd连接子-有效载荷的分子量为1034，图8（A-1）和（B-1）轻链有效载荷为0（L0）的质量和有效载荷为1（L1 = L0 + 1034 Da）的质量。随着血浆孵育时间延长，我们可以明显看到随着L1的信号下降，L0逐渐上升，这代表了轻链发生了失去一个完整的连接子-有效载荷的质量，即发生了逆迈克尔消除反应。同时还可以看到轻链逐渐生成一个L1 + 18Da的峰，根据连接子的结构和机理判断，即为琥珀酰亚胺的水解开环，此水解开环会竞争性抑制逆迈克尔消除的脱偶联反应。由于在L0和L1之间未检测到其他质量片段，说明除了完整的连接子-有效载荷的丢失之外，并未发生连接子-有效载荷的断裂，反映出T-DXd的四肽连接子设计相当稳定，有效载荷DXd也具有很高的稳定性。

图8. T-DXd在不同时间点（体外孵育0、24、96和168小时；体内给药后1、24、96和168小时）血浆样品中的去卷积质谱图（A-1：体内轻链；A-2：体内重链；B-1：体外轻链；B-2：体外重链）

而对于图8(A-2)和(B-2)显示的重链，其质谱中质量片段分布较轻链复杂很多。质谱图上显示，除了主峰H3（含三个有效载荷的质量）外还有相差162 Da的质量峰，代表单抗重链上N糖的不同糖型分布。随着孵育时间的延长，当发生整个连接子-有效载荷脱偶联时，逐渐产生DAR值为2的重链（H2），DAR值为1的重链（H1），DAR值为0的重链（H0）的成对糖型峰。除此之外，每一个连接子的琥珀酰亚胺均可以发生水解，则重链Hn （n=1, 2, 3）除了脱去质量数1034Da之外，还可以发生n个 + 18Da的质量变化。在计算DAR值时，因为水解程度是在动态变化的，且不同DAR值的质量片段的水解程度不同，因此需要将每个不同水解度的片段都计算在内。

LC-HRMS法检测DAR值的难点与对策

由于偶联了连接子和有效载荷，ADC与单抗的结构和性质存在一定差异性，在LC-HRMS进行DAR值检测时会遇到一些挑战，以下内容就其中2个主要难点进行讨论，及提供可能的对策：

免疫捕获效率

当有效载荷的位阻效应较大时，偶联后的ADC相较于单抗可能不易形成免疫结合。要想获得较好的免疫捕获效率，选择合适的捕获试剂是首要的，免疫捕获通常有针对抗体的Fc区，使用抗人Fc抗体捕获，或针对可变区用靶向的抗原蛋白捕获。由于ADC通常使用基于人源IgG的抗体，当基质为人血浆时，因为基质内充满了各种人源IgG，用抗Fc抗体蛋白提取没有选择性，这时只能使用靶点抗原蛋白进行捕获，相对成本较高；而在动物基质中，通常使用抗Fc抗体即可获得较好的提取选择性，但当捕获效率低或基质干扰偏大的时候，可能仍然需要考虑使用靶点抗原蛋白作为捕获试剂，增强选择性来提高提取效率。

免疫捕获提取回收率的优化，还可以通过调整固定相-捕获蛋白-血浆样品的比例。其中血浆样品的上样体积根据体外孵育浓度、体内给药剂量，结合仪器检测下限予以评估。捕获蛋白的用量根据预估的血药浓度适当过量，并且需要考虑对固定相的表面位点饱和，减少非特异性吸附导致的样品损失或是基质杂质残留过多。

不同DAR值的质谱响应

当有效载荷的极性、电荷分布对不同DAR值造成离子化效率不同时，都可能造成等摩尔数的不同DAR值片段的蛋白质谱响应信号差异（图9），使得DAR值的变化程度被高估或低估。当遇到这种情况时，可以通过将裸抗和最大偶联数样品按比例共混，获得响应强度的校正曲线，折算高DAR值片段相对于低DAR值片段的相对响应/相对浓度的系数，在计算DAR值时再增加一个权重系数。当有效载荷既影响捕获效率又抑制质谱响应时，高DAR值组分的响应灵敏度会受到严重的限制，尤其考虑到重链会同时叠加糖型分布、DAR分布以及水解峰分布的影响，其信号会显著低于轻链。对于有效检测浓度的预判需要充分考虑到这些问题，方法开发时进行除糖操作以及调整质谱检测模式和离子化参数。若无法获得有效的信噪比，则无法对药代动力学实验的样品进行有效的DAR值定性和半定量分析。

图9. 质谱中不同DAR值的抗体响应强度示意图

结语

随着ADC技术的不断发展，工程化突变半胱氨酸偶联技术将抗体的特殊位点突变为半胱氨酸，能在不打开链间二硫键的情况下也能得到偶联位置确定的且DAR值均一的半胱氨酸偶联型ADC，如Genentech公司的Thiomab技术^[6]。此外，也有通过对马来酰亚胺预处理使之水解开环的方式阻止逆迈克尔消除反应，或者其他不易发生脱偶联的共价结合方式进行偶联，如科伦博泰的SKB264/BT001035^[7]，使用的是甲砜基嘧啶-巯基偶联方式，以期降低脱偶联的发生。

对于抗体的质谱分析技术，研究人员也不断在开发、调整及优化，以更好地满足特定的需求，如基于微流控和毛细管电泳的分离，非变性质谱分析等方法。

药明康德DMPK建立了针对不同偶联类型ADC药物的DAR值分布研究的实验体系和高分辨质谱检测平台。从大分子蛋白角度，通过分子量定性测定生物转化并计算DAR值变化，此技术能力已赋能全球多个客户项目。结合ADC小分子释放代谢产物鉴定，我们可以帮助客户在药代动力学层面全面评价ADC药物的生物转化。

作者：施立琦，曹卫群

编辑：钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹

药明康德DMPK依托中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1700家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过2100个新药临床研究申请（IND）。

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