抗体多肽偶联药物（APC）的定量分析和生物转化研究

治疗性多肽药物因其结构精巧且具有高度特异性，能够精准结合体内特定靶点，展现出重要的治疗潜力。然而，该类药物具有分子量小、半衰期短、在体内易被快速清除等特点，为了延长其半衰期，目前常用的方式除了引入非天然氨基酸、脂肪酸链以及PEG修饰之外，还可以通过将治疗性多肽与抗体Fc段融合构建为抗体多肽融合蛋白（fusion protein）或者利用化学方式将治疗性多肽偶联至抗体构建抗体-多肽偶联药物（antibody-peptide conjugates，APC）。

上述两类药物均可借助新生儿Fc受体（FcRn）介导的回收途径延长半衰期：药物被内吞进入体内后，在酸性环境中FcRn可特异性识别并结合抗体Fc段，进而将其回收并转运至细胞表面，重新释放入血液循环，从而避免被溶酶体降解，显著延长其半衰期，减少给药频率。例如，已上市的GLP-1受体激动剂度拉糖肽便采用了Fc融合策略，并通过将肽链的第八位丙氨酸替换为甘氨酸以降低被DPP-4酶水解的风险，从而大幅提升其稳定性，使药物半衰期从数分钟显著延长至约5天^[1]。

随着fusion protein与APC在肥胖等多种疾病治疗中应用的日益广泛，其体内药代动力学行为，尤其是复杂转化过程的研究需求也日益凸显。这两类药物虽然结构有差异，但在生物分析方面仍有共性，为了简化称呼，此处将两类药物统称为抗体多肽偶联药物。本文将重点介绍抗体多肽偶联药物的整合型质谱分析平台：包括免疫亲和捕获与液相色谱高分辨质谱（liquid chromatography - high resolution mass spectrometry，LC-HRMS）以及液相色谱-串联质谱（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS），可全面解析此类药物在体内动态变化过程，不仅有助于深入理解其药代动力学/药效学（PK/PD）特性，也为新型药物的设计与筛选提供关键支持。

抗体多肽偶联药物的结构

抗体多肽偶联药物结合了抗体的结构稳定性与多肽的高亲和力及治疗功能，旨在提升药物的靶向特异性、稳定性与治疗效果。从结构上看，该类药物主要由以下三个部分组成：

• 治疗性多肽：治疗性多肽部分的设计以预期治疗功能为核心，确保其对目标靶点具备特异性结合能力和特定的生物学效应^[2]。治疗性多肽来源主要包括两类：一是通过筛选随机肽库获得，例如罗米司亭（romiplostim）（结构如图1A）中的血小板生成素（thrombopoietin，TPO）模拟肽，能以高亲和力结合并激活TPO受体；二是通过人工设计获得，如AT-02（结构如图1B）中的泛淀粉样蛋白反应肽（p5R），其作用在于引导抗体结合至不同类型的淀粉样蛋白沉积物，进而通过抗体Fc区激活免疫系统，最终清除沉积物^[3]。

• 抗体骨架：该类药物的抗体骨架主要分为两类：一是结构完整的抗体（包括天然形式与工程化改造形式），二是经基因工程改造的抗体片段（如Fc片段、scFv等）。抗体骨架不仅显著提升了整体结构的稳定性，其本身也可承担特定的生物学功能。例如，AMG133（结构如图1C）的抗体部分即为GIPR拮抗剂，该抗体骨架在增强偶联多肽血浆稳定性的同时，其拮抗活性还与多肽协同发挥减肥作用^[4]。

  
  

图1. TPO拟肽类药物罗米司亭、泛淀粉样蛋白去除 (pan-amyloid removal，PAR) 候选药物AT-02和减肥药AMG133结构^[2-4]

• 连接子：用于抗体多肽偶联的连接子（linker）主要分为三类：柔性连接子、刚性连接子和可切割型连接子。柔性连接子应用最广，可为结构域提供柔性，有利于结构域间的相互作用与运动；刚性连接子则用于维持结构域间的相对距离；可切割连接子可在体内被特定蛋白酶水解，从而释放出游离的功能结构域，以改善嵌合蛋白的生物活性（表1）^[5]。

表1. 连接子种类、功能及氨基酸序列示例^[5]

抗体多肽偶联药物药代动力学考量因素

抗体多肽偶联药物的设计旨在延长半衰期并实现靶向分布^[6]，从而优化其PK/PD关系。然而，许多候选药物在早期发现与开发阶段即面临疗效不足、免疫原性增强及稳定性欠佳等挑战。其多肽结构在体内易受血浆或组织中蛋白酶水解等生物转化过程的影响，导致两个主要结果：

• 其一，与单克隆抗体相比，抗体多肽偶联药物的半衰期显著缩短；

• 其二，与抗体偶联药物（ADC）中通常稳定的小分子毒素不同，不稳定的多肽载荷可能在抵达靶点前便丧失活性。

因此，系统开展血浆稳定性及体内药代动力学研究，以深入解析此类药物的生物转化过程至关重要。

抗体多肽偶联药物的生物分析挑战

抗体多肽偶联药物生物分析的挑战主要来自于：

1. 早期研发中，抗肽抗体（anti-peptide antibody）不易获取，传统的金标准方法的开发受限，需要质谱平台互补解决；

2. 监测治疗性多肽的稳定性至关重要，需通过全面表征以明确其具体的降解位点；

3. 总抗体分析时替代肽段的检测方法较为成熟，而完整APC的替代肽段方法存在可选的特征肽段极少、灵敏度优化难度大、多肽链中常引入非天然氨基酸及酶切空间位阻等多重挑战；

4. 生物样品体积小，待测物浓度低等因素增加了生物分析的难度。

因此，亟需整合型的质谱生物分析平台来应对该类药物的生物分析挑战。

抗体多肽偶联药物整合型质谱生物分析平台

抗体多肽偶联药物的生物分析需要对总抗体（total antibody）、完整APC（intact APC）、游离多肽（free peptide）和生物转化进行研究，并贯穿研究的各个阶段，单一平台无法全面表征，需要综合性的生物分析手段。

配体结合分析（ligand binding assay，LBA）是大分子定量研究领域的“金标准”，具有高灵敏度、高通量等优势，而对于APC的分析，面临所需的抗多肽抗体难获取、多肽部分空间位阻大等挑战。当无法获得关键试剂时，可以使用替代方法进行监测。随着质谱技术在大分子领域的发展，其在定量分析和结构表征方面的应用也越来越广泛。基于整合型质谱分析平台的抗体多肽偶联药物的定量和生物转化研究流程如图2所示。作为替代方法，LC-HRMS可用于开展以下研究：完整APC的定量分析、生物转化研究以及代谢产物分析。基于LC-MS/MS的替代肽段定量方法可用于分析完整APC与总抗体，不仅具备高灵敏度和高特异性，也避免了对抗多肽抗体的依赖，有助于缩短方法开发周期。

图2. 基于整合型质谱分析平台的抗体多肽偶联药物的定量和生物转化研究流程

抗体多肽偶联药物的稳定性和PK样品生物分析案例分享

抗体多肽偶联药物的血浆稳定性是核心问题，其多肽部分的体内转化（如蛋白酶水解）直接影响疗效。本部分将分享两个基于质谱分析平台的关键案例：一是稳定性实验样品中的转化研究；二是体内样品的定量分析。

APC稳定性及生物转化研究——LC-HRMS

抗体多肽偶联药物在进行稳定性研究时，多肽部分的生物转化可以通过LC-HRMS监测，该方法不仅可以提供非常丰富的精确分子量信息，而且即使缺乏特异性抗肽抗体，仍可以用来定量生物样品中的intact APC。我们以上市药物度拉糖肽（dulaglutide）在小鼠血浆中的稳定性研究为例，如图3所示。随着孵育时间延长，dulaglutide（分子量62561 Da）的峰强度逐渐降低，同时依次出现了分子量分别为62366 Da（G2E3）、62172 Da（G2E3+G2E3）和59436 Da（K28G29）的峰。通过其序列信息，判断其断裂位点如下：K28G29源于肽链K28与G29之间的酰胺键断裂；G2E3则由肽链G2与E3之间的酰胺键水解生成；而G2E3+G2E3则对应两条肽链均发生了G2E3位点的水解（图3和图4）。

图3. LC-HRMS研究dulaglutide的血浆稳定性及生物转化

图4. Dulaglutide单链的氨基酸序列和结构示意图

*下划线分别是Fc和GLP-1部分的替代肽段

In Vivo PK样品的多域替代肽段分析——LC-MS/MS

该方法基于酶解产生的多域替代肽段（surrogate peptide），实现对抗体多肽偶联药物不同组分的精准定量。如表2所示，通过监测dulaglutide中intact APC的替代肽段（HGE）与total antibody的替代肽段（VVS）的浓度比值（HGE/VVS），可反映多肽在体内的脱落情况，当该比值随时间下降时即提示多肽部分发生脱落。图5展示了HGE和VVS替代肽段在0.1-100 μg/mL浓度范围内的LLOQ色谱图及标准曲线，两者均表现出良好的线性关系。

表2. Dulaglutide多域替代肽段分析策略

图5. HGE和VVS肽段的LLOQ（0.1 μg/mL）图谱和标准曲线

综上所述，针对不同分析物与复杂的分析需求，药明康德DMPK建立了整合型质谱生物分析平台应用于抗体多肽偶联药物的研究，包括基于免疫亲和捕获的LC-HRMS，以及超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）。综合运用全扫描和多域替代肽段分析，能够定量监测intact APC的药物浓度并判断多肽部分的断裂位点，同时通过替代肽段的比值分析追踪intact APC与total antibody的随时间变化规律，从而精准、全面地揭示抗体多肽偶联药物的复杂转化过程，深化对其临床前及临床研究中PK/PD特性的理解。

结语

抗体多肽偶联药物的治疗优势来源于多肽与抗体功能的协同与互补，随着融合技术方法与化学偶联方法的不断创新，抗体多肽偶联药物的结构日益复杂，这对生物分析技术提出了更高要求。

药明康德DMPK凭借丰富的抗体多肽偶联药物生物分析经验，已成功搭建抗体类药物整合性生物分析平台，涵盖LBA、LC-MS/MS及LC-HRMS等体系，能够通过多维度、一体化的分析策略，完成该类药物的药代动力学与代谢转化评价。我们储备了充足的生物分析关键试剂库，开发了多种内部方法包，以缩短方法开发周期；并通过引入自动化技术，显著提升了免疫亲和捕获的效率与精密度。目前，药明康德DMPK已成功支持十余个抗体多肽融合蛋白及APC研发项目，为创新药物的研发与成功申报提供坚实的保障。

作者：何勇静、曲栗、李陟昱、邢丽丽

编辑：富罗娜·克里木、钱卉娟

设计：张莹莹

药明康德DMPK依托中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1800个新药临床研究申请（IND）。

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