酶解法解密多肽二硫键：快速、精准的表征策略

自首个多肽药物胰岛素问世近一个世纪以来，全球已有约120种多肽药物获批上市。多肽药物的研发持续稳步推进，广泛应用于糖尿病、癌症、骨质疏松症、多发性硬化症、HIV感染及慢性疼痛等疾病的治疗。据此前预测，全球肽类药物市场从2020年的628亿美元预计将增长至2025年的960亿美元^[1]。然而，早期内源性激素存在半衰期短等缺陷。为提升这些内源性配体的稳定性、效力和选择性，化学修饰成为关键手段，常见修饰包括N-末端乙酰化、N-甲基化、N/C-末端环化、聚乙二醇化以及二硫键等^[2]。

图1. 多肽药物发展史^[2]

二硫键（disulfide bond）是由两个半胱氨酸（cysteine，C）侧链巯基（-SH）氧化形成的共价键，可连接不同肽链或同一肽链的不同区域（如图2所示）。二硫键在多肽中发挥着稳定空间结构、维持正确折叠构象、调节生物活性及行使生理功能等关键作用^[3]。作为重要的化学修饰手段，二硫键的连接位点难以通过氨基酸序列直接预测，尤其是当结构中含有3个及以上半胱氨酸时。此外，合成中常采用一步随机环化工艺，进一步增加了连接位点的不确定性。然而，详细的二硫键位点信息对于蛋白质功能研究和生物药剂学质量评估至关重要^[4]。

图2. 半胱氨酸结构和二硫键结构

现有二硫键的表征方法存在适用范围窄、周期长等问题，传统流程往往涉及多条肽链合成及性质对比检测。为此，我们迫切需要一种准确、适用性强、快速的测定方法。本文利用酶解法，结合特异性酶解和非特异性酶解两种方式，使用自研软件TidesID，提供了一种快速便的途径来表征二硫键。

多肽二硫键表征常用方法

目前二硫键表征的主流方法包括酶解法、质谱碎裂法、还原法、NMR及X射线晶体学。各方法原理及特点如下：

 酶解法^[5]

利用特异性水解酶（如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等）对多肽进行酶切，通过分析酶解产物中保留完整二硫键的肽段，推断二硫键连接位点（图3）。

图3. 酶解法水解多肽示例

质谱碎裂法^[6]

采用二级碎裂方式获得丰富碎片信息，筛选可证明二硫键连接位点的特征碎片。常见碎裂方式包括：

• 高能碰撞解离（HCD）：酰胺键断裂（b/y），二硫键可能断裂；

• 碰撞诱导解离（CID）：酰胺键断裂（b/y），二硫键保持完整；

• 电子转移解离（ETD）：酰胺键断裂（c/z），二硫键裂解。

图4. 质谱碎裂法碎裂离子分类^[6]

还原法

利用还原剂（如TCEP、DTT）或光化学还原手段部分还原二硫键，结合衍生化封闭游离巯基，通过质谱分析还原前后结构变化，推断连接位点。

以柱后还原法为例（图5），在液相色谱-质谱联用过程中部分还原链间二硫键，通过对比还原前后产物的保留时间及质谱信号，即可锁定原始二硫键位置^[7]。

图5. 柱后还原法表征二硫键示例^[7]

柱后还原法适用于链间的二硫键，适用范围更广的方法是在部分还原后进行衍生化，封闭游离的巯基，再对其进行质谱分析便可以推测原始结构的二硫键连接位点。比如使用光解部分还原二硫键，再通过巯基-烯反应途径烷基化，进而分析便可以推测原始结构的二硫键连接位点^[8]。

NMR^[9]

通过分析蛋白质在磁场中的核自旋行为，解析三维结构，从而确定二硫键位置。

X射线晶体学^[10]

利用蛋白质晶体衍射图谱解析原子级三维结构，直接观测二硫键连接位点。

上述方法的优缺点总结如表1所示。综合考虑操作复杂程度，酶解法在普适性、简便性方面更具优势，因此选择酶解法进行后续实验。

表1. 二硫键表征方法优缺点对比

酶解法表征多肽二硫键实验设计

基于酶解法的优势，我们设计了两种并行实验体系，并建立配套的数据解析流程。

实验体系设计

体系一：特异性酶解

利用识别特定氨基酸序列的蛋白酶（如胰蛋白酶）进行酶切。该方法产物明确、图谱解析简单，但对多肽序列有严格要求，无合适酶切位点时无法应用。

体系二：非特异性酶解

采用非特异性蛋白酶（如链霉蛋白酶）或高浓度酶长时间孵育，获得覆盖全序列的短肽混合物。该方法适用性广，但酶解条件需细致优化，且产物复杂。

为兼顾酶解效率与产物覆盖率，建议设置多个时间点取样孵育，动态捕捉特征二硫键合肽段。

方法解析

酶解法推断二硫键连接位点的原理是通过检测特征产物，即酶解后仍保留完整二硫键并包含两个或以上半胱氨酸的肽段（如图6所示）。然而，在众多产物中快速精确地识别特征产物是一个重大挑战。

酶解法获取特征产物的难点包括：

• 如果酶解效率过低，未能在半胱氨酸之间成功酶解，导致没有特征产物生成；

• 如果酶解效率过高，二硫键发生断裂甚至错配，特征产物中混杂大量干扰，无法准确识别位点；

• 数据量庞大，人工筛选费时费力。

图6. 酶解后的保留二硫键的特征产物

数据处理与位点推断

以含3个半胱氨酸的多肽为例，其理论二硫键连接位点共有3种。实验流程如下：

1. 分别对3个不同孵育时间点的样品进行特异性酶解；

2. 采用自研软件TidesID快速筛选出各可能连接位点对应的特征产物；

3. 将特征产物列表导入Compound Discoverer软件，与样品实测数据进行筛选匹配；

4. 依据匹配成功的特征产物种类及丰度，推断最可能的二硫键连接位点（图7）。

图7. 酶解法表征多肽二硫键的数据处理流程

特异性及非特异性酶解法对比

关于两种酶解体系的适用范围及局限性，详见表2：

表2. 特异性及非特异性酶解实验体系对比

针对含3个及以上半胱氨酸的复杂环肽，药明康德DMPK制定了如下决策树（图8）：

• 优先尝试特异性酶解：若序列中存在特异性酶解位点，优先开展特异性酶解实验。若能成功匹配特征产物，直接推断二硫键连接位点。

• 采用非特异性酶解：若特异性酶解无法获得明确结论，或序列本身缺乏合适酶切位点，则进行非特异性酶解实验。通过多时间点采样、高分辨质谱检测及特征产物匹配，推断二硫键连接位点。

• 备选方案：若两种酶解策略均无法明确二硫键连接位点，则需引入还原法、质谱碎裂法或NMR等其他手段，综合解析。

图8. 多肽二硫键表征决策树

结语

近年来，多肽类药物研发持续升温，二硫键表征作为结构确证与质量控制的关键环节，始终是分析化学领域的难点。药明康德DMPK基于大量项目实践，成功开发出一套准确、快速、普适性强的二硫键表征工作流程。

该策略创新性地将特异性与非特异性酶解技术相结合，通过多时间点采样捕获丰富特征产物，结合自主研发的TidesID软件智能筛选与解析，大幅提升数据解读效率，实现复杂多肽二硫键位点的精准定位。

截至目前，该方法已在多个项目中成功应用，覆盖含3至6个半胱氨酸的多种复杂结构类型。经验表明，这一工作流可在研究初期快速明确二硫键连接方式，显著降低试错成本，为创新多肽药物的开发与质控提供可靠支持，助力客户高效、精准地推进研发进程。

作者：郁贤庆、李鹏、曹卫群

编辑：富罗娜·克里木、钱卉娟

设计：张莹莹

药明康德DMPK依托中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1800个新药临床研究申请（IND）。

点击此处与我们的专家进行联系