在过去10-15年中，体外吸收、分布、代谢和排泄（ADME）的数据在药物研发中发挥着越来越重要的作用。低成本的高通量筛选技术（High Throughput Screening, HTS）能够快速且有效地排除干扰因素，使得药物ADME单一性质的研究成为可能。结合动物体内实验数据，我们可以更精确地预测人体内药代动力学行为。液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术作为体外ADME研究平台常用分析技术，以其高灵敏度、高专一性和重复性好的特性，推动了平台朝更快、更精确的方向发展。然而，每年都会产生数百万份体外ADME高通量筛选实验样品，如早期代谢稳定性考察实验等，为传统LC-MS/MS分析的速度带来了新的挑战[1,2]。
为解决这一挑战，本文将分享几种代表性的基于质谱技术的高通量筛选分析技术及其实际应用案例。
基于质谱技术的高通量筛选分析技术
联合给药技术
联合给药分析技术，又称为N in 1或盒式分析，主要包括联合给药联合分析和单独给药联合分析两种类型。这种技术通过同时分析多种潜在化合物，加速了药物筛选和优化流程，如图1所示。盒式分析的主要优势在于减少样品数量，提高分析通量，节省时间和成本，同时对结果质量的影响较小。Jun Zhang等[3]比较了盒式分析中4、8、16、32个化合物的血浆蛋白结合实验与各自单独分析时的蛋白结合率的相关性，发现两组数据的匹配度R2均高于0.94。
在使用盒式分析时，需要考虑药物间的相互作用。一方面，结构相似的化合物如果共享相同的代谢路径，可能会导致代谢途径饱和，从而降低药物清除率。另一方面，当结构相似的化合物之间的分子量差异较小时，可能会出现质谱干扰或抑制问题。解决这些问题通常需要借助其他设备，比如引入液相色谱（LC）分离或使用高分辨质谱，以增强系统的分离能力。尽管存在这些挑战，但盒式分析在早期药物发现过程中仍是一种有效的筛选技术。
图1. 联合给药技术
（a）联合给药联合分析；（b）单独给药联合分析
多重液相技术
多重液相质谱分析技术是通过多个LC系统与单个质谱仪的联合实现的。多个独立的LC系统通过切换阀依次接入质谱仪。这样做的优点是在不影响LC分离效率的前提下，将包含目标色谱峰的部分液相引入质谱仪，其余部分切入废液中，提高质谱检测的有效占比。根据目标洗脱时间与总梯度时间的需求，可以交替使用多个LC流，如两套交替LC，理论上通量最大可提升2倍，见下图2。
尽管交替更多的LC可以节省时间，但也会受到两方面的限制。首先是质谱采集窗口，交替更多的LC会导致每个通道的窗口变窄，可能使保留时间差异较大的化合物不能同时进入质谱仪。其次是系统复杂性，交替更多的LC需要更多的配合与协调，使系统更加复杂。因此，目前通常采用两套液相进行交替进样。Jingtao Wu等[4]利用双重交替液相技术同时分析含有奥沙西泮和氨甲喋呤的血浆样品，在不牺牲色谱分离效果的前提下，将原来的每个样品分析时间从6分钟缩短到3分钟，实现样品分析通量双倍提升。
图2. 多重液相技术
（a）传统分析模式；（b）两套液相系统交替；（c）四套液相系统交替
在线SPE分析技术
在线固相萃取分析技术(On-Line SPE)，也被称为"Trap and Elute"模式，与之前的多重色谱技术相比，提供了更高的分析速度，最快可达到每10秒处理一个样品，但色谱分离能力有所降低。
图3描绘了在线SPE分析技术的典型模式。首先，样品中的化合物被较弱洗脱能力的流动相携带进入约10 mm的小柱（Cartridge）进行保留，样品中的盐类等随流动相被送入废液中。然后，通过切换阀门，引入洗脱能力较强的流动相，将小柱中保留的化合物洗脱并送入质谱进行检测。在线SPE技术在高通量筛选平台中得到了广泛的应用，例如Rapidfire系统、 ADDA（Apricot Designs Dual Arm）系统以及LeadSampler (LS-I)系统，特别是后者可以支持多种LC应用和工作流，在在线SPE技术的基础上，复合了多重液相技术以及微流色谱技术，满足不同应用场景下的分析需求。John Janiszewski、Brendon Kapinos等[5,6]先后对ADDA系统以及LS-I系统对体外药代动力学药物相互作用（DDI）, 代谢稳定性等实验进行了验证和评估。
图3. 在线SPE分析技术
通常经历四个阶段（a）上样；（b）保留去盐；（c）洗脱；（d）再平衡
声波激发质谱联用技术
声波激发质谱技术（Acoustic Ejection Mass Spectrometry, AEMS）将声波移液技术与质谱检测技术创新地结合在一起，主要包括三部分：(1) ADE：声波激发进样装置；(2) OPI：开放端口接口；(3) ESI-MS：基于ESI离子化技术的质谱。在这个系统中，声波激发装置将样品液滴（2.5 nL）从样品板的一个小孔弹射到倒置的开放端口OPI中。接着，溶剂泵以每分钟200至500 µL的速度将样品从OPI通过转移管推送至离子源，然后被质谱检测。主要原理图见图4。
基于其独特的设计，AEMS具有较好的基质耐受性、系统残留较小等优点[7,8]，此外，AEMS将分析速度推动到了秒级范围内，最快可以达到1秒6个样品[9]，这可以推动高通量质谱分析的每日通量达到10万个，足以媲美荧光检测，大大地提高了我们现有的分析速度，更加适应未来的高通量发展趋势。
图4. ADE-OPI-MS系统示意图[2]
其中（1）ADE：声波激发进样装置；（2）OPI：开放端口接口；（3）ESI-MS：采用ESI离子化技术的质谱
药明康德DMPK高通量质谱分析技术实践
药明康德药物代谢与动力学部Non-GLP生物分析团队具有丰富的高通量药物筛选经验，先后建立了包括：联合给药药物分析、多重液相联用质谱、快速在线SPE分析以及声波激发质谱联用技术等高通量药物筛选技术应用平台，支持早期药物筛选、体外药代动力学、生物标记物的快速生物分析以及化合物质量控制（Quality Control, QC）的高通量筛选，提供多样化、快速化的生物分析解决方案（图5，表1），交付高质量的分析数据，加速客户药物研发进程。
图5. 药明康德DMPK高通量质谱分析技术应用平台相关仪器
表1. 药明康德DMPK多样化的高通量质谱分析平台特点
技术 | 样品 运行时间（s） | 日通量 | 特点 |
多重色谱技术 | 15~30 | ~103 | 灵活地支持各类色谱梯度并缩短分析时间 |
在线SPE技术 | 10~15 | ~104 | 速度快，支持大量样本分析。目前用于质谱检测前处理，最快的在线色谱净化技术之一。 |
声波激发质谱技术 | 1~2 | ~105 | 速度快，支持超高通量的样本分析，具有较高的基质耐受性和重现能力 |
案例一：基于在线SPE技术，质谱分析快速检测5-氨基乙酰丙酸
5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）是一种光敏感药物。在光治疗中，5-ALA被代谢生成原卟啉IX，当暴露在特定波长的光下会产生细胞毒性的活性氧，从而被用于治疗多种癌症，包括皮肤癌、食道癌、胶质母细胞瘤和膀胱癌等。5-ALA由于极性比较大，反相色谱系统中不容易保留，常见的分析方法包括衍生化、离子交换色谱等技术，而这通常需要较长的分析时间。在这项研究中，我们利用快速在线SPE技术，12秒一个样品定量分析5-ALA，可以支持大量样品的检测。
图6. 基于在线SPE技术高通量定量分析5-ALA
上：5-ALA 色谱图；下：线性拟合图
案例二：基于声波激发质谱快速完成化合物质控
在药物发现中，高通量化合物质控（QC）有广泛的应用场景，包括但不限于检测化合物板准备，挑选化合物的完整性以及微孔板化学合成反应监控等。由于需要监测大量的样品（通常每批次数千个），这会给传统的LC-MS分析平台带来验证负担。而基于声波激发质谱技术的高通量筛选技术由于直接的、非接触式液体采样、最小化的样品消耗和超快的分析速度等优点提供了可行性。我们利用声波激发质谱技术Echo MS在4个小时内完成了近5000个化合物QC工作，而传统的LC-MS分析平台则需要约10天时间。
结语
回顾过去，质谱分析技术在体外ADME高通量分析平台上发挥了越来越重要的作用。随着新技术（如人工智能）、新分子实体、新筛选应用以及新理念（如自动化、数字化等）的不断涌现，高通量质谱分析技术将迎来更多具有创新性的应用方向和解决策略，这些创新共同推动其在高通量筛选领域的持续发展和完善，从而推动体外ADME高通量筛选平台朝着更加精准和高效的方向发展，最终将有助于缩短药物研发周期，加速新药的发现和上市，从而更好地服务于人类健康事业。
作者：苏远强，文欣欣，李小童，邢丽丽
编辑：方健，钱卉娟
设计：倪德伟，张莹莹
药明康德DMPK依托中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1800个新药临床研究申请（IND）。
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参考
[1] James N Kyranos; et al. High-throughput high-performance liquid chromatography/mass spectrometry for modern drug discovery, Current Opinion in Biotechnology, Volume 12, Issue 1, 2001, Pages 105-111.
[2] McLaren, David G; et al. High-Throughput Mass Spectrometry for Hit Identification: Current Landscape and Future Perspectives. SLAS Discov. 2021 Feb;26(2):168-191.
[3] Jun Zhang, et al. Cassette incubation followed by bioanalysis using high-resolution MS for in vitro ADME screening assays, Bioanalysis, VOL. 4, NO. 5, 2012.
[4] Wu J.T. The Development of a Staggered Parallel Separation Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry System with On-Line Extraction for High-Throughput Screening of Drug Candidates in Biological Fluids. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2001; 15: 73-81.
[5] John Janiszewski, et al. Development of a high-speed, multiplexed sample-delivery instrument for LC-MS/MS bioanalysis，Bioanalysis. 2012 May;4(9):1039-56.
[6] Kapinos B. et al. Development of a High-Performance, Enterprise-Level, Multimode LC–MS/MS Autosampler for Drug Discovery. Bioanalysis. 2017; 9: 1643-1654.
[7] Hui Zhang, Chang Liu, et al. ADE-OPP-MS: the Next Generation High Throughput BioAnalytical Platform for Drug Discovery. SLAS 2018.
[8] Liu C, et al. Operational Modes and Speed Considerations of an Acoustic Droplet Dispenser for Mass Spectrometry. Anal Chem. 2020 Dec 15;92(24):15818-15826.
[9] Häbe, TT, Späth, C, Schrade, S, et al. An ultrafast and flexible liquid chromatography/tandem mass spectrometry system paves the way for machine learning driven in vivo sample processing in early drug discovery. Rapid Commun Mass Spectrom. 2021; 35:e9096.
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