药物代谢酶CYP450诱导机理及体外评估模型解析

药物相互作用（Drug-drug interaction，DDI）指的是同时使用多种药物时，药物之间产生的药代动力学和药效动力学改变。作为新药风险评估的重要环节，NMPA和FDA分别于2021年和2020年更新了药物相互作用研究的指导原则^[1,2]，国际人用药品注册技术协调理事会（ICH）也于2022年发布了ICH指导原则《M12：药物相互作用》^[3]。药物相互作用研究在药代动力学方面主要涉及代谢酶和转运体。其中代谢酶介导的药物相互作用评估主要包括三个方面：药物代谢酶表型鉴定的研究，药物代谢酶的抑制作用评估以及药物代谢酶的诱导作用评估。本期文章主要介绍药物代谢细胞色素 P450（Cytochrome P450, 简称CYP酶）的诱导作用评估。

临床上如果供试品为CYP酶的诱导剂，那么它会降低本身（自诱导）或者其他合用药物（CYP酶底物）在体内的暴露量，从而降低药物疗效；同时由于促进代谢产物的生成，可能增加代谢产物相关的毒性和不良反应风险；此外它也可促进前药生成更多活性代谢物进而增加疗效或风险。许多物质可以被CYP酶活化以形成活性代谢物在体内发挥作用，如氯吡格雷需经CYP酶(CYP2C19，CYP3A4等) 氧化代谢成有活性的代谢产物（硫醇代谢物），从而发挥抗血小板聚集的作用。利福平强烈诱导 CYP2C19，导致氯吡格雷活性代谢产物水平增加和血小板抑制，可能增加出血风险。作为一项预防措施，氯吡格雷的临床用药不建议联合使用强 CYP2C19 诱导剂^[4]。下表为CYP酶诱导引发的临床药物相互作用的代表性组合^[5]。

表1.CYP酶诱导引发的典型的临床药物相互作用

若药物相互作用研究不充分，可能会妨碍对在研药物获益及风险的确定，进而导致药品上市后应用范围受限制，或直接影响药物的上市申请进程。因此全球各主要药监当局均推荐开展药物相互作用研究，包括CYP酶诱导试验。

CYP酶诱导机理

核受体已被证明参与CYP酶的表达调控，包括孕烷X受体 (PXR)、组成型雄烷受体 (CAR)、芳烃受体（AHR）等^[6]。这3个核受体均为转录因子，在与配体结合激活后，核受体从细胞质转运入细胞核。其中，PXR和AhR分别与细胞核内的视黄醛X受体（RXR）和转运蛋白（ARNT）形成异源二聚体，进而结合在相应靶基因上（如CYP酶），调节CYP酶的表达（图1）。AhR参与CYP1A2的诱导；PXR主要参与CYP3A4的诱导，其次是2C亚家族；CAR与PXR的诱导谱非常重叠，此外有研究表明CAR还可以诱导CYP2B6。

不同种属中PXR和CAR的DNA结合结构域高度保守，但其配体结合结构域差异很大。因此与配体结合的种属差异对将动物数据转化为人体数据产生了较大的阻碍。一个典型的例子是利福平能有效激活人的PXR，但在小鼠中激活效果不佳。相反，PCN(孕烯醇酮-16α-腈)更容易激活小鼠的PXR而不是人的PXR。为了克服配体结合偏好的物种差异问题，人们开发了PXR和CAR人源化小鼠模型^[7]。

图1.PXR响应元件。PXR与RXR形成异二聚体后与靶基因启动子区，AGGTCA核苷酸重复序列结合，进而调控靶基因的表达。

此外有些CYP酶水平也受到转录后调节的影响，比如受到蛋白稳定剂或者mRNA稳定剂的调节。有研究表明乙醇、丙酮、吡唑以及异烟肼^[7]可以稳定CYP2E1。核不均一核糖核蛋白A1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1，hnRNP A1）可以结合到小鼠Cyp2a5 mRNA 3′-末端进而稳定小鼠Cyp2a5 mRNA。人CYP2A6也存在着类似的调节机制。近些年有研究表明microRNA也可以对CYP酶进行转录后调节^[7]。

CYP酶诱导体外评估体系及优缺点分析

在药物研发早期通过体外测试评估药物对CYP酶诱导的潜力，进而规划适当的临床药物相互作用研究是很重要的。临床前通常在可铺板的、冷冻保存或新鲜分离的原代人肝细胞中研究药物作为CYP酶诱导剂的可能性。也可以使用其他体外系统，例如永生化肝细胞系和核受体激活试验，但是这些研究的结果通常被认为是支持性的，而不是确定性的。如果使用非原代人肝细胞体系作为主要方法，申办方应提供理由解释采用这些体外系统的适当性。

PXR/AhR核受体激活实验

通常采用癌细胞系进行PXR核受体激活实验，例如采用瞬时或者稳定转染PXR和报告基因的HepG2或HuH7癌细胞，报告基因常采用如荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶或胎盘分泌碱性磷酸酶。工业界利用稳定转染了PXR和AhR核受体的人肝癌细胞系（PXR：DPX2^TM；AhR：1A2-DRE^TM）和荧光报告基因来评估供试品对CYP酶的诱导。目前暂时没有评估CAR核受体激活实验的模型。核受体激活实验的设计比较灵活，可以根据需求调整，一般采用2到6个复孔，浓度可以选择单个浓度或者多个浓度以获得E_max和EC₅₀。这类实验的优点是通量相对较高，实验周期较短，经济节约，在药物发现阶段是很有价值的工具。但是在IND申报阶段不太适用，建议使用原代人肝细胞模型。

原代人肝细胞模型

在适当的培养条件下，人肝细胞能在一段时间内保持分化并对诱导剂做出反应。原代肝细胞模型是工业界、学术界和监管机构最为广泛接受的评估CYP酶诱导的模型。作为细胞系统，人肝细胞由核受体、共激活因子和抑制因子、靶基因和启动子以及作为能够进行生物转化的药物代谢酶等组成，这些特性类似于肝脏，能有效地模拟候选药物及其代谢物的诱导性。

以下为原代人肝细胞模型实验设计的要点:

• 先考察受试物对CYP3A4、 CYP2B6和CYP1A2酶的诱导。如果根据体外结果可以排除受试物对CYP3A4酶的体内诱导可能性，则无需评价药物对CYP2C酶的诱导可能性，因为CYP3A4和CYP2C酶都是通过激活PXR诱导的。

• 在mRNA水平上评估酶诱导的程度，同时建议检测酶活。如果仅测量酶活性，当同时存在抑制作用时，可能会掩盖诱导作用。

• 应对系统进行验证，以证明主要的CYP酶均具有功能且可被阳性对照药物诱导。CYP1A2、 2B6和3A4阳性对照的响应值（mRNA倍数变化）至少增加4倍的肝细胞批次，其灵敏度通常认为比较合适。

• 一般需孵育48-72小时，以达到对酶的完全诱导，并每天更换含有药物的培养基。如果药物的稳定性较低，可以考虑更频繁地添加药物。

• 进行乳酸脱氢酶（LDH）释放实验监测细胞毒性，以评估细胞毒性是否可能影响诱导反应。

• 3个供体肝细胞， 3-5个浓度^[3]，至少三份重复样本。ICH M12指导原则推荐浓度范围覆盖15×C_max,u（C_max,u为稳态最大血浆游离药物浓度，FDA和NMPA指导原则推荐30×C_max,u为预期肝脏药物浓度），如果不适用，比如化合物在肝脏浓度特别高，则应考虑覆盖受试物在肝组织的浓度。此外应结合体外溶解度和肝细胞毒性结果来综合设计CYP酶诱导浓度。

案例分析

案例一

受试物在药效模型的血浆稳态C_max为16μM，血浆蛋白结合率为80%，如何设计肝酶诱导实验中的受试物孵育浓度？

指导原则建议受试物的浓度范围应覆盖临床治疗剂量下预期的肝脏药物浓度（例如稳态最大血浆游离药物浓度的30倍），同时应结合体外溶解度和肝细胞毒性结果来设计。C_max=16μM，f_u=0.2，则30*C_max,u=96μM。（1）如果化合物溶解度≥ 100μM，但在100 μM下受试物有肝细胞毒性，最后设计的浓度为：50、15、5、1.5、0.5μM。（2）假如化合物溶解度只能达到30μM，则建议浓度设定为30、10、3、1、0.3μM。

案例二

细胞毒性对数据解读的影响：

乳酸脱氢酶（LDH）释放实验可以监测受试物对肝细胞的毒性，当受试物某一浓度下LDH释放相对溶媒对照组LDH释放百分数大于130%，认为该浓度下受试物对肝细胞存在毒性。通常细胞毒性会降低诱导倍数，比如导致诱导剂引起的CYP酶mRNA 变化倍数小于2，进而无法评估该浓度下受试物对CYP酶的诱导效应。这个案例中10μM受试物对供体3具有细胞毒性，但即使存在细胞毒性，供体3中CYP3A4 mRNA变化倍数仍旧大于2，所以不能排除10µM受试物对CYP3A4有诱导的可能性。

案例三

CYP酶诱导实验数据解读：

• 乳酸脱氢酶（LDH）释放实验表明在所有测试浓度下都不会对肝细胞产生毒性。

• 受试物在3个供体中CYP1A2的mRNA表达相对溶剂对照变化倍数小于2倍，表明受试物在所有测试浓度下均不是CYP1A2的诱导剂。

• 受试物在3个供体中多个测试浓度下CYP2B6和CYP3A4的mRNA表达相对溶剂对照变化倍数大于2倍，且以浓度依赖的方式增加，因此在相应供体和浓度下是CYP2B6和CYP3A4的诱导剂。

• 考虑到受试物对CYP3A4诱导倍数较高，建议增加受试物对CYP2C诱导的实验。

• 对于2B6和3A4可以尝试计算受试物对其诱导的E_max和EC₅₀，采用相关性计算方法来评估临床药物相互作用风险。根据同一酶的一组已知诱导剂（至少包括2种弱诱导剂）的诱导得分（RIS= (E_max×I_max,u)/(EC₅₀+I_max,u)）或 I_max,u/EC₅₀ 的校准曲线，预测在研药物临床诱导作用的程度（如在存在和不存在诱导剂时，指针底物的AUC变化），如图2所示^[8]。如果 AUCR≤ 0.8 (对应%Decrease in AUC≥ 20)，则认为该药物在体内具有潜在的诱导作用。有时由于在研药溶解度或细胞毒等情况所限，E_max 或EC₅₀难以确定，则可采用其它的经过验证的相关性方法，比如AUC/F2^[9] （AUC为临床血浆暴露量，F2为mRNA表达高于溶媒组2倍时受试物浓度）。除了相关性方法之外，还可以借助基础动力学模型、静态或动态机制模型（如PBPK模型）预测临床药物相互作用风险。

图2.米达唑仑和几种诱导剂分别联合给药后，米达唑仑暴露量下降比例与诱导剂RIS的关系^[8]

案例四

供体差异和CYP酶下调:

考虑到供体的差异（年龄，疾病状态，是否吸烟，药物治疗），为了保证研究的有效性（validity），减少假阴性概率，诱导实验至少使用3个供体，应对每个供体的诱导结果进行单独评价。如果药物在至少一个供体肝细胞中表现出诱导性，则不能排除其体内诱导可能性，应进一步评价其诱导可能性，例如使用来自另一个供体的肝细胞进行体外试验。

上表中，从受试物相对溶剂对照mRNA的表达倍数来看，在所有3个供体中，受试物浓度为1μM时都是1A2的诱导剂；在供体2和3中，受试物浓度为1μM时是3A4的诱导剂，在供体1则没有表现出对3A4的诱导性。

此外受试物在10μM测试浓度时，CYP3A4酶活和mRNA表达以及CYP1A2 mRNA表达相对0.1和1μM均出现下调。当出现下调的情况时，应考虑下调是否是浓度依赖，以及该受试物是否为抑制剂（尤其是否是时间依赖性抑制，Time-dependent inhibition，TDI）或者酶的灭活剂，还应该考虑到mRNA或活性的下降是否与细胞毒性或其他作用机制相关（与CYP诱导相关的miRNA相互作用，白细胞介素-6介导的下调，干扰核受体等^[10]）。在这个案例当中，根据LDH释放实验结果排除细胞毒性相关原因。对于CYP3A4酶活的下调，可以关注下是否由于酶活抑制引起，mRNA表达下调的机制比较难以评估，可以考虑增加浓度点以便进一步观察是否存在浓度依赖。在酶诱导实验中应该关注CYP酶和mRNA表达下调的现象，因为这也可能引发药物相互作用的风险。TDI引发的酶活下调可能因酶而异（isoform-specific），而涉及核受体引发的下调可能涉及到多个共调节的酶和转运体。

结语

在药物研发的早期可以考虑PXR/AhR核受体激活实验来对受试物进行评估。在临床申报阶段，采用人肝细胞进行研究，在mRNA水平和酶活水平上测定酶诱导的程度。有几种方法可用于解释体外诱导试验的mRNA数据，并评估药物在体内诱导酶的可能性。建议首先采用基本定性方法（mRNA倍数变化）。如果基本方法表明有诱导可能性，则可以继续使用更多的定量方法（例如相关性方法）进行评价，前提是可以进行较大浓度范围内的在研药物的诱导作用研究，以确定诱导参数例如E_max和EC₅₀。基本定性方法仅使用在研药物的体外数据，而相关性方法则是将药物的诱导反应与多种已明确的人体内酶诱导剂进行比较。此外也可以使用静态机制模型或PBPK模型。如果根据体外数据和模型无法排除诱导的风险，则应使用关注酶的敏感底物进行临床研究。对于CYP酶诱导作用风险的评估，有助于阐明相关药物相互作用风险，明确药物联用禁忌，顺利推动药物的上市申请进程。

针对CYP酶诱导评估，我们可以提供PXR/AhR核受体激活实验和肝细胞诱导模型的服务，肝细胞诱导模型可以覆盖CYP3A4、 CYP2B6、CYP1A2以及CYP2C8、2C9和2C19亚型，提供包含mRNA和酶活的数据，赋能客户的药物研发。

作者：陈松，马利萍，孙建平，金晶

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹

药明康德DMPK依托中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1700家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过2100个新药临床研究申请（IND）。

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