皮肤给药体内生物样品定量检测的挑战及策略解析

皮肤，是人体最大的器官，也是最容易被忽视的器官。它像人体的“统管大将军”，率领了全身多达三分之一的血液。它又像人体的“万里长城”，铸成了抵御外界威胁的重要屏障。经皮给药是一种古老而有效的给药方式，受到业界青睐。经皮给药体内实验产生的生物样品定量评价具有一定的难度：对于血浆样品极低的定量检测下限要求，对于皮肤组织样品及特殊的角质层样品的定量检测需要对应的方法。本文我们将介绍经皮给药的方式，体内外药代动力学研究途径，重点阐述经皮给药各种体内生物样本的定量检测策略，难点及注意事项。

经皮给药方式介绍

皮肤由外至内总体分为四层（如图1）：角质层是非常薄的最外层皮肤，厚度约10-20微米，由死细胞组成；活性表皮约0.2毫米厚，是药物结合、代谢和转运的区域；真皮约3-4毫米厚，富含胶原蛋白；皮下层是皮肤的最内层，厚达几厘米，是脂肪的重要存储部位^[1,4]。

图1. 皮肤的结构^[2]

如果药物只能达到表皮，不能透过真皮，称为局部给药（topical），治疗领域包括皮肤癌、牛皮癣、湿疹和微生物感染等，疾病的根源在皮肤上；如果药物能够进入体循环，称为透皮给药（transdermal drug delivery system，TDDS），透皮给药倍受生物医学等领域的青睐，适用于多种疾病的治疗，包括抑郁症，高血压，心绞痛，精神分裂，阿尔兹海默症等。

透皮给药强大的市场应用潜能与其优势是密切相关的：

• 可避免口服给药发生的肝脏首过效应及胃肠道刺激；

• 维持恒定的血药浓度；

• 减少给药频率，延长有效作用时间；

• 体表用药，可随时中断给药，且患者可自主用药，是一种非常方便的给药途径。

经皮给药的药代动力学研究

体外研究

基于经皮给药的优点，越来越多的药企致力于皮肤给药的研究，在体外研究方面体外释放（in vitro release test，IVRT）及体外渗透（in vitro permeation test，IVPT）试验（详见：体外透皮试验（IVPT）在皮肤外用制剂开发中的应用）是评价皮肤局部外用制剂药学研究中的重要技术手段，是以人工膜或动物的离体皮肤，动态测量给药一定时间内的透过药量和透过速率，分别考察半固体制剂或贴剂的释放行为或药物在皮肤的渗透行为。扩散池技术是目前体外试验采用的经典方法（图2），该方法是将人工膜或离体皮肤，夹在扩散池中央，并将扩散池分割成供给室（donor chamber）和接受室（receptor chamber），药物置于供给室，然后在设定时间点取一定接受液来检测药物浓度。除了对接收液进行定量分析外，在体外研究中还涉及到对供给室清洗液的分析，IVPT试验还涉及到表皮，真皮以及角质层的分析。对于体外皮肤给药定量分析，药明康德药物代谢与动力学部生物分析团队积累了丰富的经验。

图2. 扩散池示意图

体内研究

体外实验具备简单易行，实验结果容易重复等特点，但与实际皮肤给药的条件存在一定差距，不能体现皮肤血流及酶代谢等情况的影响，因此经皮给药系统的开发还需进行体内药代动力学研究。体内药代动力学实验主要研究药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄的规律，对于药物体内的作用过程以及生物利用度等研究具有不可替代的作用。本文将重点介绍皮肤给药体内生物样品的定量检测^[3]。迷你猪和人的皮肤在诸多方面相似，再加上其颜色浅，使迷你猪皮肤成为体内研究的理想选择。由于皮肤的多层结构，定量检测的迷你猪基质包括血浆、表皮、真皮、皮下组织、整个皮肤以及角质层。将上述基质分为三类，一是血浆样品，二是皮肤组织样品，三是角质层样品。下文结合药明康德药物代谢与动力学部的研究经验介绍这三类基质的分析难点或注意事项，希望对关注皮肤给药的研究者有所帮助。

经皮给药生物样品定量检测策略

血浆样品分析

血浆样品是此类实验中最常见的一种基质类型，如果是皮肤局部给药，实验目的不希望药物入血，体内暴露基本为0；如果是透皮给药，一般给药剂量较小，且药物不能完全穿透具有多层生物膜结构的皮肤，故经体内吸收的量少，对血药浓度的检测要求极高的灵敏度。这也是皮肤实验测定血浆样品中的最大挑战。针对极高灵敏度的要求，在液质联用平台上，药明康德药物代谢与动力学部生物分析团队从质谱、液相和样品前处理三个方面综合考量，以提高化合物的质谱信号响应。在实验方法经过调整优化后，我们使用上市化合物右美托咪定进行验证实验，皮肤给药后血浆样品的分析定量下限可达到3 pg/mL，线性拟合良好（r=0.9998，如图4）。在血浆样品分析中，还需要根据化合物的性质关注化合物的基质稳定性和非特异性吸附问题（详见：非特异性吸附的产生和解决策略），用以评估样品采集、存储、前处理和上清溶液中的完整性，保证测定的浓度能真实地反映药物在体内的实际浓度。

图3. 右美托咪定的结构式

图4. 右美托咪定血浆线形图，定量下限为3 pg/mL

皮肤组织样品分析

皮肤组织样品分析的意义

皮肤组织样品的生物分析，在新药的发现与开发直至上市后治疗监测的各个环节，对确认候选药物与靶点的结合，了解其安全性、有效性和体内分布，以及建立药代动力学-药效学关系至关重要^[5]。可以通过组织样品的定量分析来评估药物的组织摄取，尤其是对皮肤局部给药，系统性暴露基本为0，所以药物在靶组织即皮肤组织的暴露数据就显得更重要。

皮肤组织样品匀浆

活体采集皮肤样本之后，药物代谢与动力学部体内团队具有丰富的冷冻切片分离皮肤组织各层的经验。此后关键的步骤是将固体样品转化成液体形式用于LC-MS/MS分析，组织匀浆通常是首选的制备方案。考虑到皮肤组织样品与其他组织样品相比含有胶原蛋白和弹性蛋白，尤其是真皮样品的匀浆不易均质化，还需要兼顾化合物的溶解度，和非特异性吸附等因素，因此匀浆液和匀浆比例至关重要。目前在皮肤样品匀浆中常用的匀浆液为有机溶液和PBS混合溶液，较大的匀浆比例通常可以增加匀浆样品的均一性。值得一提的是在样品前处理过程中较大的取样体积在某种程度上可以抵消匀浆分散不佳带来的影响，以提高分析的重现性。

皮肤组织样品分析

使用LC-MS/MS平台进行特定组织样品的分析一般在血浆样品的分析方法基础上进行优化调整，对于皮肤组织样品有两个注意点：第一相对于血浆样品而言，皮肤组织匀浆样品含有多种细胞组织和不同含量的各类磷脂等其他内源性化合物^[5]，基质效应的影响不可忽略，否则会因为干扰组分与待测物共流出而导致定量浓度的不准确性；第二皮肤实验中一般待分析的基质种类较多，每种基质样品个数少，且如表皮等组织重量轻，因此可选择合适的替代基质制备校正标样和质控样品，缩短分析时间。

皮肤组织样品分析流程及其他研究平台

对于皮肤组织样品的分析，除了LC-MS/MS方法（图5总结了LC-MS/MS法分析皮肤组织样品的一般流程），药明康德药物代谢与动力学部还有基于组织切片的样品研究方法--定量整体放射自显影技术（详见：“看得见”的去向—定量全身放射性自显影技术使组织分布实现可视化），可以得到可视化且完整的组织分布结果。

图5. LC-MS/MS法分析皮肤组织样品的一般流程

角质层样品的分析

角质层非常的薄，需要特殊的样品采集方式，胶带剥离采样法被广泛接受和使用，也是FDA推荐的角质层采集方式。这是一种非侵入性的技术，通过重复应用适当的胶带采集角质层样品（图6）。这种非常规的采样方式必然会带来一些非常规的分析要求：第一胶带剥离下来的是固体的样本（图7），进质谱需要变成可进样的液体状态（图8），但不能像皮肤组织样品采用匀浆的方式；第二由于空白基质的特殊性使得标准曲线和质控样品不能采用常规的方法制备。

图6. 胶带去除角质层的示意图

图7. 样品处理前

图8. 样品处理后

角质层样品前处理流程

带着这两个问题，我们设计了如图9所示的实验方案。第一对于未知样品和空白胶带，需用合适的溶剂将待测分析物尽可能完全的“浸泡”出来。我们设计通过剪刀剪碎胶带，溶剂浸泡定容到一定体积，超声，放置过夜等流程，保证分析物最大程度的提取；第二对于线性和质控样品，理论上应该完全按照样品流程操作，但是考虑到繁琐的样品处理过程，选择一种替代的方式将线性和质控样品的工作液直接加入到含有角质层的空白胶带的上清溶液中进行后续分析。

图9. 角质层样品前处理流程图

验证实验

由于标准曲线和真实样品前处理方式的不一致，需要设计一个验证实验证明上述过程的可靠性。我们采用质控样品模拟真实样品，并保持与真实样品相同的处理过程，而线性样品仍采用将工作液加入到含有角质层的空白胶带的上清溶液中的替代方式。验证结果表明，使用替代方式的实验准确度可以满足分析要求（表1为其中一个化合物验证实验的结果）。因为角质层的采样非常特殊，故胶带的品牌，剪刀剪碎的过程，内标的加入等操作都需要格外的注意。

表1. 替代方式验证实验结果

结语

随着人口老年化，慢性病患者数量增加，消费者在医疗大健康或者美容方面的支出增加等趋势，皮肤给药的市场需求不断增加。且皮肤给药具备诸多优势，越来越多的研发者致力于这一领域的研究，皮肤给药的可能性得到扩展：改变给药途径老药新用，开发已上市药物皮肤给药的应用；其他皮肤给药活性成分不断研发；不同的制剂技术比如柔性脂质体等的研究发展，使大分子的经皮给药成为可能^[6]。药明康德药物代谢与动力学部制定了从皮肤体内实验制剂优化、给药、体内样品采集及生物样品定量分析的一套完整的项目方案，能够高效的完成试验，提供准确可靠的数据，助力皮肤给药的药物研发进程。

作者：高莉，任彦甫，邢丽丽

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟

药明康德DMPK依托中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1800个新药临床研究申请（IND）。

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