1902年，德国科学家Hermann Emil Fischer开拓了对蛋白质的研究，确定了氨基酸通过肽链形成多肽。1922年，胰岛素首次发现且被用于治疗1型糖尿病。此后，多肽因为其广泛的生理调节作用、显著的活性、选择性和低毒性等特点进入到药物研发的领域。在过去的十几年中随着生物医药研发投资的浪潮，多肽药物也获得了更多的关注与进展。目前全球市场已经有超过120种多肽药物上市，超170种多肽在临床研发阶段和超600个临床前研究管线[1-2]。
但多肽药物也有不可忽视的弱点，它的化学与生理稳定性都比较差，特别容易受到体内蛋白水解酶的降解，造成口服吸收差、代谢快、半衰期短等问题，给多肽药物的研发带来了很多挑战。药代动力学研究可以帮助指导多肽药物的结构优化、评估合适的给药途径、确定代谢相关种属，是多肽药物研发中的重要环节。此前在：多肽药物的研发和药代动力学研究策略 一文中介绍了药代整体研究思路，本文将从多肽药物的代谢方式，如何进行代谢考察及提高代谢稳定性的方法等方面为大家展开介绍。
多肽药物的代谢酶与位点
肽键是蛋白水解酶的天然代谢位点，多肽药物将被蛋白水解酶逐渐清除或代谢成活性或非活性代谢物。已知大约有560种人和640种小鼠蛋白酶，这些代谢过程发生的非常广泛而快速，造成多肽药物在体内过短的半衰期。下图展示了蛋白水解酶的分类及催化方式[3]。
图1. 蛋白酶主要类型[3]
内肽酶（Endopeptidases）破坏分子中间的肽键。它们的催化机理与水解过程中涉及的化学基团有关，可以细分为五个不同的类别：天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。外肽酶（Exopeptidases）特异性地在多肽的N-末端或C-末端切割底物，因此可以细分为氨肽酶和羧肽酶。
肽酶对多肽的代谢是非特异性和多重的。一种肽酶可以代谢许多不同类型的底物；或者一个底物可以通过多个肽酶代谢，并且是连续的多级降解步骤。多肽在体内的代谢方式通常是先通过内肽酶代谢为寡肽，再通过外肽酶进一步降解为氨基酸，随后参与机体的蛋白质合成等各种生化过程[4]。
蛋白酶主要分布在血浆、胃肠道、血脑屏障、肝、脾、肾等组织中，使得多肽药物的吸收和组织分布较差，造成给药方式的不便利以及不能抵达治疗部位等缺陷。下面是主要的蛋白酶种类和代谢方式。
表1. 主要的蛋白酶种类和代谢方式
蛋白酶 | 裂解位点 | 相关氨基酸 |
胃蛋白酶 | 芳香族氨基酸的氨基和酸性氨基酸的羧基形成的肽键 | Leu、Phe、Trp、Tyr（N端残基） |
胰蛋白酶 | 碱性氨基酸的羧基形成的肽键 | Lys、Arg（C端残基） |
胰凝乳蛋白酶 | 水解芳香性氨基酸 | Phe、Tyr、Trp（C端残基） |
弹性蛋白酶 | 水解脂肪族氨基酸羧基形成的肽键 | Ala、Gly、Ser、Val（C端残基） |
氨肽酶 | 水解寡肽的氨基末端肽 | |
羧肽酶A, B | 水解中性和碱性氨基酸的羧基末端肽 | Phe、Ty、Trp或Leu Lys or Arg |
二肽基肽酶IV (DPP IV) | N-端的第2位氨基酸残基为Ala或Pro的降解 | Ala、Pro |
DPP IV在肾脏、小肠、上颌下腺和肝脏中大量存在，部分以可溶形式存在于循环血液中。pH值约为7.8时活性最佳，即使在pH 5-10的较宽范围内活性仍较稳定。DPP IV对蛋白酶抑制剂丙氟磷（Diisopropyl Fluorophosphate, DFP）非常敏感，但对其它常见的丝氨酸蛋白酶抑制剂，如对硝基苯磷酸二乙酯（diethyl p-nitrophenylphosphate）和苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的敏感性要低得多[5]。
胰高血糖素样肽（glucagon-like peptide-1, GLP-1）是促进胰岛素分泌和控制血糖的重要激素。其在体内被DPP IV快速降解，在人中的半衰期仅为0.9分钟[6]。GLP-1受体激动剂如艾塞那肽、利拉鲁肽、度拉糖肽、司美格鲁肽等具有类似天然GLP-1的作用，同时因为结构优化降低了DPP IV造成的代谢，延长了作用时间，被用于治疗2型糖尿病和减重。DPP IV抑制剂西格列汀（sitagliptin）等也被用做治疗糖尿病的药物。
胃肠道代谢
胃肠道中含有大量的蛋白酶，成为影响多肽吸收的主要屏障。这些蛋白酶有三种来源
管腔分泌的酶，包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和羧肽酶A, B;
刷状缘膜结合酶，包括各种羧肽酶和氨基肽酶；
胃肠道上皮细胞细胞质中的蛋白酶及其它氧化酶。
有文章研究了17种多肽药物在胃肠液中的稳定性[7]，按照氨基酸数目分成了三类药物。a）小于12个氨基酸，部分或者全部为环状结构的5个药物；b）小于12个氨基酸的7个线性多肽药物；c）大于12个氨基酸的5个药物。
研究结果表明在人胃液中，较大的多肽包括抑生长素，降钙素，促胰液素，胰高血糖素和胰岛素被迅速代谢，而较小的肽表现出良好的稳定性。但在人小肠液中，除了环状的环孢素和含有二硫桥的奥曲肽和去氨加压素外，小肽和大肽都迅速降解。模拟胃液和猪胃液中肽的稳定性与人胃液中的稳定性密切相关。胃液中大肽的快速降解可能是由于多种因素，例如存在大量胃蛋白酶敏感肽键，高结构灵活性和更多氢键受体/供体，产生更高的极性表面积，从而增加了与胃蛋白酶的相互作用。
图2. 胃肠道中蛋白酶的分泌与活化[8]
1)图左侧标记：
Pepsinogen: 胃蛋白酶原；Pepsin: 胃蛋白酶；Oligopeptide: 寡肽；Tripeptide: 三肽；Dipeptide: 二肽；AA: 氨基酸2)图右侧标记：Enterokinase: 肠激酶；Trypsinogen: 胰蛋白酶原；Trypsin: 胰蛋白酶；Pro-carboxypeptidase: 羧肽酶原；Carboxypeptidase: 羧肽酶；Chymotrypsinogen: 胰凝乳蛋白酶原；Chymotrypsin: 胰凝乳蛋白酶
肝脏代谢
多肽药物大多疏水性较低，不能通过被动扩散进入肝细胞。需要通过载体介导的跨膜转运以及内吞作用和胞吞作用进入肝细胞后被代谢[9]。在肝细胞膜上发现的与低密度脂蛋白（Low Density Lipoprotein, LDL）受体相关的受体可能参与纤溶酶原激活剂的代谢。一项关于两种胰高血糖素样肽-1（GLP-1）代谢物在人肝细胞和小鼠肝细胞中的代谢研究显示，这两种代谢物均在N端快速代谢，但在C端不代谢[10]。鲑鱼降钙素是另一种由肝脏代谢的肽，当与大鼠肝脏匀浆体外孵育时，鲑鱼降钙素首先在His17-Lys18和Val8-Leu9键处裂解，然后通过外切肽酶（氨基肽酶/羧肽酶）进一步降解这些裂解产物[11]。
肝脏中的CYP450酶也可以代谢多种多肽药物。如阿片类肽H-Tyrd-AlaGlyPhed-LeuOH（DADLE）的前药对CYP450氧化敏感[12]。
肾脏代谢
多肽根据分子量的大小在肾脏中主要通过两种机制进行代谢。大分子多肽经肾小球滤过后通过内吞作用和溶酶体降解被清除，最终水解成小肽和氨基酸。分子量较小的多肽经肾小球滤过后被近端小管刷状缘膜上的外肽酶水解为氨基酸，然后通过特定的氨基酸转运系统重吸收进入体循环或降解为小肽并转运至近端小管上皮细胞。肽转运蛋白 1 (PEPT1) 和 PEPT2 参与了寡肽的重吸收机制。
大鼠皮下注射醋酸特立帕肽后，药代动力学数据显示肾脏是其分布和降解的主要器官，但排泄作用不明显[13]。利钠肽（natriuretic peptides, NPs）的代谢也是一个例子，D型NPs (DNPs) 已被证明与其他NPs（如心房 NPs）相比在兔血浆中更稳定，进一步研究了DNP在其他器官中的代谢，结果表明肾脏是其降解的主要器官[14]。
血液代谢
多肽药物多为亲水性，相比组织器官更容易与血浆中的蛋白酶接触而被降解[15]。例如，缓激肽被人血浆中发现的蛋白酶迅速降解。神经肽Y（Neuropeptide Y, NPY）在人血清中孵育时也通过蛋白水解裂解代谢。NPY1-36可以迅速转化为三种代谢物，并且可以通过抑制DPP IV、氨基肽酶P和激肽释放酶来阻止这种降解过程[16]。
图3. 缓激肽的结构和被血管紧张素转换酶、激肽酶Ⅰ、DPP IV、氨基肽酶降解位点[16]
其它组织中的代谢
多肽药物因为较差的口服生物利用度，临床最常见的给药途径为静脉注射或皮下给药。当通过皮下给药时，药物在进入到系统循环前在皮下组织中也会发生代谢。皮下间质液（subcutaneous interstitial fluid, SIF）中含有与血浆类似的蛋白酶，但含量只有血浆的1/3，与淋巴液类似[17]。皮下组织的白蛋白含量小于血浆，对于与白蛋白结合以延长半衰期的多肽，在皮下组织中的游离比例比血浆中高，因此皮下组织是其主要代谢部位。Ito等人在大鼠皮肤组织样品中孵育亮丙瑞林，以解释体内观察到的低SC生物利用度[18]。
受体介导的代谢
多肽药物因为较好的靶点亲和力，因此较大比例药物分子会与靶受体结合。多肽药物与细胞膜表面靶受体结合后通常会被内化进入细胞，并被胞内的内体或溶酶体降解。由于靶受体数量有限，该消除途径容易饱和。因此，该途径是多肽或大分子药物非线性PK特性的重要原因之一。与组织细胞上表达的靶受体相比，在血液中表达的靶受体一般对多肽药物消除的影响更显著。
多肽稳定性测试及代谢位点考察
如上文所述，多肽在血液、肝脏、肾脏、胃肠道、皮肤等组织中都易被蛋白酶代谢，所以体外经常采用全血或者血浆37度孵育考察稳定性，此外肝脏S9、肾脏S9、模拟胃肠液、皮肤匀浆液等也是推荐的稳定性测试体系。值得注意的是因为多肽的低渗透性，体外S9、匀浆液等体系可能会高估多肽药物在体内组织中的代谢程度。多肽的代谢产物通常也具有生物活性，临床前可以采用高分辨质谱HRMS研究多肽的代谢位点和产物，帮助指导结构优化以提高稳定性，并关注占比较高代谢物的活性和毒性。
如果了解药物的主要代谢酶种类，那采用重组的蛋白酶进行稳定性测试将会提供更直接的结果。但目前有商品化提供的蛋白酶种类较少，也可以考虑用特异性的蛋白酶抑制剂来考察化合物代谢减少的程度。
表2. 部分蛋白酶抑制剂
酶委员会编号 （EC number） | 推荐名称、别名 | 抑制剂 |
3.4.14.5 | Dipeptidyl-peptidase IV | Cd2+, Diprotin A, Hg2+, Leu, Lys, Met, PCMB, SrCl2, Zn2+, Ala-thiazolidide, Ile-thiazolidide, NVP DPP728, valine-pyrrolidide |
3.4.13.3 | X-His dipeptidase | 1,10-Phenanthroline, Co2+, Dithiothreitol, Homocarnosine, EDTA |
3.4.13.9 | X-Pro dipeptidase | Daunorubicin, Doxorubicin, p-Chloromercuribenzoate |
3.4.15.1 | Peptidyl-dipeptidase A (ACE) | Captopril, EDTA, snake venom peptide |
3.4.16.2 | Lysosomal Pro-X carboxypeptidase | Diisopropyl fluorophosphate, Pepstatin, phenylmethylsulfonyl fluoride |
3.4.17.2 | Carboxypeptidase B | 6-Amino-n-hexanoic acid, Co2+, EDTA, SDS, Urea |
改善多肽代谢稳定性的方法
针对多肽药物代谢快、作用时间短的问题，药物化学家已经探索出了多种改善多肽代谢稳定性的方法。
将L型氨基酸替换为D型氨基酸或非天然氨基酸
生物体内的蛋白酶主要识别位点为天然的L型氨基酸，所以将代谢位点的L型氨基酸换成的D型氨基酸可以减弱与蛋白酶的亲和力，并能基本保持多肽的生理活性。
曲普瑞林（10肽）是一种促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone, GnRH）类似物。它将天然GnRH的1、6、10位替换成了三种非天然氨基酸残基，静脉注射后它的半衰期相比天然GnRH的5分钟延长到了2.8小时，主要通过肝脏和肾脏清除[19]。
图4. 曲普瑞林结构式（红色位点为非天然氨基酸残基）[19]
N-或C-端修饰
线性肽两端的氨基酸残基容易受到外肽酶的降解，因此将末端残基通过甲基化或N-乙酰化方式修饰可以起到代谢保护的作用。
葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（Glucose-dependent insulinotropic polypeptide, GIP）（1-42）的半衰期只有2-5分钟，Mabilleau等人通过乙酰化GIP中的Tyr1（N-AcGIP）开发了一种酶促稳定的GIP类似物，体内半衰期大于24小时。
环化或双环化
线性肽的构型不稳定，容易变形与蛋白酶催化中心结合。采用环化的方法可以稳定多肽构型，减小与蛋白酶的结合常数（Ka），降低与蛋白酶的亲和力。同时还可以将两端或者代谢位点的氨基酸残基保护起来，是增强多肽稳定性的一种有效方式。目前已经上市的多肽药物中超过2/3都是环肽化合物[20]。
自然界来源的很多抗菌类药物是环肽，如环胞菌素（Cyclosporine），达托霉素（Daptomycin）等。环孢素对胃肠道肽酶高度稳定（孵育2小时后>90%保持完整）[21]。Sandimmune®是其一种基于脂质的制剂，而Neoral®是一种具有提高生物利用度的微乳化制剂。其终末半衰期范围为口服给药后5至18小时。
兰瑞肽（Lanreotide）是14肽生长抑素（somatostatin）的8残基环肽类似物，用于治疗由垂体过度释放的激素引起的肢端肥大症（巨人症）和不可切除的晚期或转移性胃肠胰神经内分泌肿瘤 (GEP-NETs)。研究者开发了1个月持续释放的皮下长效制剂（Somatuline Autogel® 和 Somatuline Depot®）以避免每日注射。兰瑞肽在第1位和第4位包含2个非天然氨基酸残基，然后是酰胺化的Thr8，将其消除半衰期延长至23至30天，而内源性生长抑素为3分钟[22]。
PEG修饰
PEG有多种与药物相关的性质：高水溶性，高流动性，低毒性和免疫原性，易从体内清除。当药物被PEG修饰后，也得到一些类似的性质，而且这些性质的传递与PEG的分子量正相关。在肽链末端进行PEG化修饰不仅可以保护氨基酸残基，而且会显著增大分子量和空间位阻。Lee等人的研究表明，GLP-1的位点特异性PEG化导致大鼠血浆半衰期增加16倍[23]。
使用大分子量的PEG修饰的另一个重要作用是减少肾小球滤过率，降低肾清除率。两种机制共同作用可以大大延长体内的消除半衰期。
添加配体提高与白蛋白或IgG的结合
生物体内的白蛋白或IgG会采用新生儿Fc受体（FcRn）循环途径来避免降解。当白蛋白内化进入细胞后，内体中pH 6的环境下其与FcRn结合力较强，保护白蛋白不被溶酶体降解。之后结合体被释放到细胞外在生理pH 7.4的环境中释放出白蛋白。针对此途径，研究者在多肽结构中进行脂肪链修饰以结合白蛋白，利拉鲁肽、司美格鲁肽均通过此方式方式显著提升了半衰期。其它研究手段还包括将多肽与白蛋白共价结合、重组表达等[24]。
图5. FcRn循环[24]
除了以上方式之外，与酶抑制剂联合用药、采用脂质体等缓释制剂保护游离多肽等方式也可以延长药物体内半衰期。
结语
加深对多肽代谢稳定性的了解，及早发现代谢机制和位点可以帮助研究者进行结构改造以提高药物稳定性，对多肽临床开发的成功非常重要。如今已经有多款长效多肽药物及缓释递送制剂成功上市。相信随着更多研究的开展，包括多功能肽、多肽偶联药物等新分子类型，将使多肽有机会应用于更多的疾病领域。
作者：孙建平，金晶
编辑：方健，钱卉娟
设计：倪德伟
药明康德DMPK依托中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1800个新药临床研究申请（IND）。
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参考
[1]Wang L, Wang N, Zhang W, Cheng X, Yan Z, Shao G, Wang X, Wang R, Fu C. Therapeutic peptides: current applications and future directions. Signal Transduction and Targeted Therapy, 7:48, 2022. http://doi.org/10.1038/s41392-022-00904-4
[2]W.Zhang, S.Lu, G.Zheng, et al. “Mechanism-Informed Machine Learning Enables Discovery of Oncolytic Peptides for Cancer Immunotherapy.” Advanced Science (2026): e75652. http://doi.org/10.1002/advs.75652
[3] Pernot M, Vanderesse R, Frochot C, Guillemin F, Barberi-Heyob M. Stability of peptides and therapeutic success in cancer. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2011 Jul;7(7):793-802.
[4] Yao JF, Yang H, Zhao YZ, Xue M. Metabolism of Peptide Drugs and Strategies to Improve their Metabolic Stability. Curr Drug Metab. 2018;19(11):892-901.
[5] Neil D. Rawlings and Guy Salvesen (Auth.) - Handbook of Proteolytic Enzymes-Academic Press (2013)
[6] Zhu, L.; Tamvakopoulos, C.; Xie, D.; Dragovic, J.; Shen, X.L.; Fenyk-Melody, J.E.; Schmidt, K.; Bagchi, A.; Griffin, P.R.; Thornberry, N.A.; Roy, R.S. The role of dipeptidyl peptidase IV in the cleavage of glucagon family peptides in vivo metabolism of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-(1-38). J. Biol. Chem., 2003, 278, 22418-22423.
[7] Wang J, Yadav V, Smart AL, Tajiri S, Basit AW. Toward oral delivery of biopharmaceuticals: an assessment of the gastrointestinal stability of 17 peptide drugs. Mol Pharm. 2015 Mar 2;12(3):966-73.
[8] Kurz A, Seifert J. Factors Influencing Proteolysis and Protein Utilization in the Intestine of Pigs: A Review. Animals. 2021; 11(12):3551. http://doi.org/10.3390/ani11123551
[9] Authier, F.; Posner, B.I.; Bergeron, J.J.M. Endosomal proteolysis of internalized proteins. FEBS Lett., 1996, 389, 55-60.
[10] Sharma, R.; McDonald, T.S.; Eng, H,; Limberakis, C.; Stevens, B.D.; Patel, S.; Kalgutkar, A.S. In vitro Metabolism of the Glucagon-Like Peptide-1 (GLP-1)-Derived Metabolites GLP-1(9-36)amide and GLP-1(28-36)amide in Mouse and Human Hepatocytes. Drug Metab. Dispos., 2013, 41, 2148-2157.
[11] Liao, S.; Qie, J.K.; Xue, M., Zhang, Z.Q., Liu, K.L., Ruan, J.X. Metabolic stability of human parathyroid hormone peptide hPTH (1-34) in rat tissue homogenates: Kinetics and products of proteolytic degradation. Amino. Acids, 2010, 38, 1595-1605.
[12] Nofsinger, R.; Fuchs-Knotts, T.; Borchardt, R.T. Factors that restrict the cell permeation of cyclic prodrugs of an opioid peptide, part 3: Synthesis of analogs designed to have improved stability to oxidative metabolism. J. Pharm. Sci., 2012, 101, 3486-3499.
[13] Serada M, Sakurai-Tanikawa A, Igarashi M, Mitsugi K, Takano T, Shibusawa K, Kohira T. The role of the liver and kidneys in the pharmacokinetics of subcutaneously administered teriparatide acetate in rats. Xenobiotica. 2012 Apr;42(4):398-407.
[14] Kim, S.M.; Kim, S.Y.; Kim, S.H.; Kim, S.Z. Dendroaspis natriuretic peptide is degraded by a metalloproteinase in the rat kidney. Mol. Med. Rep., 2014, 9, 1037-1043.
[15] Laine J.; Murphey, David L.; Hachey, John A.; Oates, Jason D.; Morrow, Nancy J. Metabolism of bradykinin in vivo in humans: Identification of BK1-5 as a stable plasma peptide metabolite. J. Pharmacol. Exp. Ther., 2000, 294, 263-269.
[16] Abid, K.; Rochat, B.; Lassahn, P.G.; Stocklin, R.; Michalet, S.; Brakch, N.; Aubert, J.F.; Vatansever, B.; Tella, P.; De Meester, I. Kinetic study of Neuropeptide Y (NPY) proteolysis in blood and identification of NPY3-35 a new peptide generated by plasma kallikrein. J. Biol. Chem., 2009, 284, 24715-24724.
[17] Simone Esposito Dr., Laura Orsatti Dr. & Vincenzo Pucci Dr. (2022): Subcutaneous Catabolism of Peptide Therapeutics: Bioanalytical Approaches and ADME Considerations, Xenobiotica
[18] Ito Y, Murano H, Hamasaki N, Fukushima K, Takada K. 2011. Incidence of low bioavailability of leuprolide acetate after percutaneous administration to rats by dissolving microneedles. Int J Pharm 407(1–2):126–131.
[19] Muller FO, Terblanchè J, Schall R, van Zyl Smit R, Tucker T, Marais K, Groenewoud G, Porchet HC, Weiner M, Hawarden D (1997) Pharmacokinetics of triptorelin after intravenous bolus administration in healthy males and in males with renal or hepatic insufficiency. Br J Clin Pharmacol 44(4):335–341.
[20] A. Zorzi, K. Deyle and C. Heinis, Cyclic peptide therapeutics: past, present and future, Curr. Opin. Chem. Biol., 2017, 38, 24–29.
[21] Wang J, Yadav V, Smart AL, Tajiri S, Basit AW (2015) Toward oral delivery of biopharmaceuticals: an assessment of the gastrointestinal stability of 17 peptide drugs. Mol Pharm 12(3):966–973.
[22] Brian Chia, C.S. A Review on the Metabolism of 25 Peptide Drugs. Int J Pept Res Ther 27, 1397–1418 (2021).
[23] Lee SH, Lee S, Youn YS, Na DH, Chae SY, Byun Y, Lee KC (2005) Synthesis, characterization, and pharmacokinetic studies of PEGylated glucagon-like peptide-1. Bioconjug Chem 16: 377–382
[24] Kurtzhals, P., Østergaard, S., Nishimura, E. et al. Derivatization with fatty acids in peptide and protein drug discovery. Nat Rev Drug Discov (2022).
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