超越5原则的环肽药物：如何提升代谢稳定性和膜渗透性

多肽药物因其高活性、高特异性、低副作用以及与抗体类药物相比更低的生产成本而备受青睐。然而，因分子量大、极性表面积高、酰胺键易水解等原因，其代谢稳定性、膜渗透性和口服生物利用度较差，限制了多肽药物的发现与开发。近年来，噬菌体展示和mRNA展示等技术的发展推动了多肽文库在药物开发中的应用，使理性设计成为发现多肽的重要手段。

多肽药物根据其结构特征可分为线性肽和环肽。研究发现环肽在类药性上具有一定优势，如构象稳定、无不稳定末端氨基酸残基和分子内氢键形成，这些特性使环肽极性低、亲和力强、稳定性高，并提高了渗透性，可被用于口服给药或者作用于细胞内靶点。截至2024年6月，共有66个环肽药物获得批准，其中39个在2000年之后获批^[1]。2023年批准的6款多肽药物中，有3款是环肽药物：瑞扎芬净（Rezafungin），用于治疗念珠菌血液感染的棘白菌素药物；莫替福肽（Motixafortide），首款靶向趋化因子受体CXCR4治疗多发性骨髓瘤的多肽药物；泽勒普肽（Zilucoplan），首个皮下注射补体C5多肽抑制剂，也是目前唯一可自行给药的全身型重症肌无力（gMG）疗法。根据Research and Markets的一份最新报告，大环肽和订书肽（本质上也属于环肽）药物市场将从的12.2亿美元（2024年）增至47.6亿美元（2030年），复合年增长率为21.44%。尽管环肽具有潜在的优势，但代谢稳定性和膜渗透性差等主要障碍仍需解决。下文分别从这两方面来了解环肽的相关研究。

表1. 环肽与线性肽的性质比较

提高环肽稳定性

提高环肽的稳定性主要采用以下几种方法。

1. 修饰肽链的骨架，包括使用D-氨基酸、非蛋白源性氨基酸、β-/γ-氨基酸和N-甲基化。生物电子等排体修饰可能在不影响活性的情况下产生最佳结果。

2. 筛选合适的环化形式以及双环化，可以降低构象柔性，减少因外肽酶催化引起的代谢。

3. 二级结构可以通过α-螺旋、β-链和环、分子内氢键和订书结构，或者通过使用α/β-肽来维持和增强螺旋度。

生长激素抑素（Somatostain）是一种14肽的环肽激素，主要由下丘脑促垂体区细胞分泌，胰岛D细胞、胃肠道也可产生。其体内半衰期很短，很难用于疾病治疗。根据稳定性研究改造其结构，用D-氨基酸替换L-苯丙氨酸和L-色氨酸，将C端羧基变换成醇基，同时保留药效团，最终得到8肽类似物奥曲肽（Octreotide）。改造后可以减少内肽酶的催化作用，将半衰期从3分钟延长到100分钟^[2]，已上市用于治疗肢端肥大症、腺瘤和胰腺、乳腺、前列腺肿瘤。

图1. 生长激素抑制素修饰成为奥曲肽（红色为药效基团）

在单环肽的基础上，科学家采用双环策略开发出与尿激酶纤溶酶原激活物结合的多肽，结果显示双环肽比其线性和单环对应物更稳定，在鼠血浆中孵育24小时后仍有40%原药存在^[3]。

图2. 双环肽的连接方式^[3]

提高环肽膜渗透性

被动渗透是药物穿过生物膜的主要途径，它通常需要分子量小、脂溶性好等特点。Christopher A. Lipinski和同事在1997 年发布了开发口服小分子药物的理化性质类药5原则，后来又有研究增加了极性表面积变成“扩展的5原则”。含有6个以上残基的多肽明显超过了这些限度，然而这并不意味着多肽不能透过生物膜。研究者在自然界丰富多样的环肽中发现了一些渗透性良好的分子。

表2. 基于上市口服小分子药物理化性质的“扩展的5原则”

环孢素 A 是从真菌Tolypocladium inflatum中分离得到的一种环肽。尽管其特性超过了扩展的5原则，但令人惊讶的是其表现出异常好的稳定性和渗透性，口服生物利用度在20%-70%之间。这可能归因于Nα-甲基化和非蛋白氨基酸的替代。另一个关键机制涉及其“变色龙”行为。环孢素分子可以根据周围环境调节构象。当进入脂质双层时，它可以内化极性原子，当扩散到水性细胞内环境时，它恢复到活性构象。

环孢素 A 的案例激发了对超出扩展 5 原则的化合物的研究。其中一项研究建立了一个环肽和类肽数据库，如图所示，其中两个理化参数EPSA（experimental polar surface area）和ClogP与环肽通透性相关^[4]。观察到，虽然EPSA值低于90 Å2不能保证良好的渗透性，但它确实显著改善了化合物的前景。CLogP值在7.5和10之间有利于渗透性，因为亲脂性更高或更低均会对渗透造成障碍。几项研究揭示了环肽的相似边界，如表3所列。这些发现可以为合理设计环肽提供一个很好的起点。

图3. EPSA, CLogP与MDCK细胞渗透性的相关分布^[5]

表3. 环肽药物设计的超越5原则^[6]

N-甲基化可以修饰环肽的构象、氢键结合电位和亲脂性，得到适宜的理化性质从而增强其膜通透性。例如Veber-Hirschmann肽，一种生长抑素合成类似物，该类似物保留了生长抑素的活性序列，并表现出受体选择性，再通过N-甲基化修饰开发得到一个新的类似物，使其Caco-2渗透性从1 x 10^-6 cm/s提高到4 x 10^-6 cm/s^[7]。

另一种有前景的方法是细胞穿透肽（CPPs），在20世纪90年代初被发现，此后已鉴定出近2000种具有细胞穿透活性的多肽。其中，环状CPPs与线性CPPs相比，表现出优越的稳定性和胞质转运效率。环状CPPs直接与质膜磷脂结合，通过内吞或直接转位进入细胞。因此，它们可以作为载体来运输多肽药物。内环偶联法可以将线性肽和小肽与环状CPPs融合，而外环和双环偶联法适用于较大的多肽和环肽。对于某些靶蛋白，肽配体必须呈线性形式才能具有生物活性。因此，可逆性环化或双环化偶联法被设计用于在胞质中释放线性肽，以进行靶向结合^[8]。

图4. 细胞穿透肽1（CPP1）^[8]

口服环肽药物开发

心血管病是全球人口死亡的首要原因，而高胆固醇血症是引起动脉粥样硬化性心血管病（主要包括冠心病和缺血性卒中）的重要危险因素。降血脂的主要治疗药物包括他汀类、贝特类药物，而约50%使用他汀类药物的个体无法将其低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平降低至预期水平，并且面临不良反应多、需要联合给药、长期服药等问题。近年来，PCSK9抑制剂为各类难治性高胆固醇血症患者提供了新的治疗方法和希望，其通过降解LDL-C来调控血脂。目前全球共上市3款PCSK9抑制剂，包括依洛尤单抗（Evolocumab）、阿利西尤单抗（Alirocumab）两款单抗，及一款小核酸药物英克司兰（Inclisiran），展现出超越他汀类药物的安全性和治疗效果。依洛尤单抗2022年销售额已达到12.96亿美元，其他两款药物也有望成为10亿美元的重磅药物。但这三款药物也存在皮下注射依从性差、价格昂贵等限制，因此开发新型口服PCSK9抑制剂成为热点。

MK-0616是一款口服环肽PCSK9抑制剂，用于治疗成人高胆固醇血症。2023年8月已经启动三期临床试验，有望成为首款口服PCSK9抑制剂。其研发过程首先通过mRNA展示技术发现苗头多肽化合物，再基于结构的药物设计进行优化获得最终的分子。化合物44易受大环化过程中掺入的硫化物的化学氧化影响，重要修饰是取代巯基接头和中央三唑（红色至蓝绿色），以最大限度地减少氧化敏感性（44 = 98%，MK-0616 = 2.9%），同时保持效力（44 Ki = 2 pM，MK-0616 Ki = 5 pM），并将烯烃更改为酰胺交联剂以增加溶解度（通过降低亲脂性）并避免烯烃形成产生的异构体^[9]。

图5. 先导化合物44结构优化为MK-0616 ^[9]

在被动渗透性测定中，MK-0616的跨细胞渗透性（Papp）非常低（0.71 x 10^-6 cm/s）。临床试验制剂中使用癸酸钠（sodium caprate）或辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（Labrasol）作为渗透促进剂增加肠道吸收，在200 mg剂量下，含有Labrasol的制剂与不含Labrasol的制剂相比，MK-0616的C_max高出5倍（45.3 nmol/L 比7.84 nmol/L）, AUC_0-inf高出2倍（1250h·nmol/L比556 h·nmol/L）。100 mg剂量下含有Labrosol和癸酸钠的暴露量类似，生物利用度约2%。在10到300 mg剂量范围内，AUC_0-inf 低于剂量线性增长，半衰期为35小时至130小时左右。

高脂肪早餐（55.6 g脂肪、55 g碳水化合物、31.1 g蛋白质）后30分钟给予40 mg剂量的MK-0616，其AUC_0-inf和C_max与在禁食条件下给予相同剂量的几何均值比值（进食/禁食）分别为0.33和0.25，说明进食条件不利于其口服吸收。

图6. MK-0616单次给药后血药浓度曲线^[9]

在二期临床试验中，MK-0616每天一次给药8周后显示出安慰剂调整后的LDL-C（低密度脂蛋白胆固醇）降低，具有统计学意义和稳健的剂量依赖性，从基线降低最高达60.9%，并且在8周的治疗和额外的8周随访期间耐受性良好^[10]。

MK-0616的两项三期临床试验已经在2023年启动，有望成功上市并因为优异的疗效、安全性和便利性成为重磅药物，根据行业预测其有潜力在销售高峰期达到年销售50亿美元。MK-0616的研发路径与临床结果为大环肽的研发提供了前行的方向。结合mRNA展示技术、基于结构的修饰提高稳定性和溶解度、使用渗透促进剂等，可使超越五原则的大环肽达到可行的口服生物利用度。

结语

多肽药物的市场规模近年来快速增长，环肽药物独特的构象为研发更有效、更安全、更便利的药物提供了极具潜力的解决方案，MK-0616等在研口服环肽药物的优异表现更是成为广受关注的焦点。因其不同小分子和线性肽和结构特征，其DMPK的研究思路和目标也有不同的要求。总结已上市和在研环肽药物的数据可发现超越5原则的特征，我们在理化性质、代谢稳定性、渗透性等研究中也开发和设计了针对性的实验方法和方案，建立从筛选到IND申报的研究策略，以终为始地为客户项目赋能。

目前在研的环肽管线已经有几百项进入到临床阶段，用于治疗包括肿瘤、感染性、血液系统疾病，相信这些研究将在不久的将来帮助更多患者重获健康和幸福生活。

作者：孙建平，马利萍，金晶

编辑：钱卉娟，富罗娜·克里木

设计：倪德伟，张莹莹

药明康德DMPK依托中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1700个新药临床研究申请（IND）。

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