mRNA药物临床前药代动力学评估策略
随着两款mRNA疫苗在临床上大获成功，mRNA疗法在全球掀起研发热潮。不仅在疫苗领域，在治疗药物领域，mRNA也能发挥巨大潜力。理论上mRNA可以翻译成任何蛋白，以蛋白为治疗手段的药物均可以被mRNA疗法替代。且mRNA能在细胞内表达蛋白，克服常规蛋白疗法难以递送至细胞内，只能靶向细胞外靶点的不足。除此之外，相比于蛋白类药物，mRNA的生产成本更低，研发周期短，使得mRNA药物具有很大的优势。那么，针对这一新类型的药物，其药代动力学评价需要如何开展呢？
一、mRNA药物的分类和特性
mRNA药物根据所编码的蛋白类型可分为两大类：一类为编码抗原蛋白，称之为mRNA疫苗。根据疾病类型，可进一步分为针对感染性疾病的疫苗和肿瘤疫苗。另一类为编码非抗原蛋白发挥作用，称之为mRNA治疗药物。根据蛋白的种类，又可细分为编码抗体、酶、细胞因子、生长因子、甚至编码基因编辑蛋白发挥基因编辑作用等。每一种类型，目前均有一些药物已经进入临床阶段[1,2]。
图1. mRNA药物的分类
mRNA疫苗和治疗药物在药物性质上有一定区别。
mRNA疫苗编码抗原蛋白，一般仅需少量蛋白表达即可发挥作用，刺激机体产生免疫原性是其药效的体现。与之不同的是，mRNA治疗药物一般需要大量蛋白的表达，同时希望减少免疫原性的发生，因为免疫原性会降低蛋白的浓度。
在递送上，疫苗没有组织特异性需求，但mRNA治疗药物希望被递送到特定的组织后进行翻译。
在给药方式上，疫苗多采用肌肉注射，因为肌肉组织血流丰富，免疫细胞分布较多，而mRNA治疗药物根据治疗目的，多采用系统给药或靶组织局部给药。总体而言，mRNA疫苗开发技术成熟，mRNA治疗药物开发面临诸多挑战，包括提高蛋白表达量，减少免疫原性，提高组织靶向性，发挥长效作用，长期重复使用的安全性等。
二、mRNA药物药代动力学研究考量因素
根据FDA和NMPA发布的疫苗相关技术指导原则，疫苗通常不需要进行常规的药代动力学研究，但某些特殊疫苗应进行生物分布的研究。mRNA疫苗正是属于一类特殊疫苗，需要进行生物分布研究。从mRNA药物的作用机理来看，mRNA疫苗编码抗原蛋白，借助免疫系统发挥放大作用，药效的持续与抗原的表达量和表达时间不直接相关；而mRNA治疗药物编码功能性蛋白，由蛋白直接发挥作用。其药效持续与蛋白的表达量和表达时间相关，也就是存在一定的量效关系。这也是为何，mRNA疫苗通常不需要进行药代动力学研究，而mRNA治疗药物的药代动力学研究有助于理解药物的量效关系。
mRNA药物的结构也会影响药代研究。完整的mRNA药物结构包含5个部分，分别为5’端加尾区，5’端和3’端非编码区（UTR），编码区，3’端PolyA加尾区。目前针对mRNA药物的结构优化策略主要有以下几种。从药代研究角度，扩增型mRNA的给药剂量相对较低，对检测灵敏度提出更高的要求；环型mRNA的PCR扩增，需要包含Junction site，证明其成环。
- 5’ 加帽和3’ 加尾修饰，提高mRNA稳定性
- 5’ UTR和3’ UTR优化，提高翻译效率
- 编码区化学修饰提高翻译效率，降低先天免疫
- 自我扩增型mRNA和反式扩增型mRNA
- 环型mRNA
图2. mRNA药物的结构及常见优化策略[2]
mRNA的递送系统也是研发的热点之一。单链mRNA容易被核酸酶降解，且其高度电负性不容易穿过细胞膜，需要借助一定载体递送至靶细胞。目前最常用的递送系统为LNP（Lipid nanoparticle），也有开发细胞外囊泡比如外泌体，仿生囊泡，甚至采用细胞进行mRNA递送。药代动力学研究最为关注的是LNP递送系统，因为其主要成分之一的可离子化阳离子脂质被认为是引起细胞毒性的主要成分，而PEG脂质容易引起免疫原性。如果LNP中阳离子脂质或其他成份为新型药用辅料，需要遵从《新药用辅料非临床安全性评价指导原则》，“按照临床相关的给药途径，以与非临床安全性评价中相同的动物种属来研究辅料的吸收、分布、代谢和排泄”。
图3. LNP递送系统构成图[2]
三、mRNA药物的药代动力学研究内容和案例分析
如下表所示药代研究通常包含吸收、分布、代谢、排泄和药物相互作用。对于mRNA疫苗而言，正如前面提到不需要进行药代研究，一般只需要进行生物分布研究。对于mRNA治疗药物，需要进行吸收和分布研究。对于新的药用辅料，需要开展完整的ADME研究。药用辅料潜在药物相互作用风险需根据实际情况进行评估。
表1. mRNA药物药代动力学研究内容
案例1：mRNA疫苗的生物分布研究
左图为辉瑞BNT162b2疫苗的生物分布结果，采用LNP包裹荧光素酶mRNA替代进行研究。理论上LNP的作用决定了递送的组织特异性，装载不同mRNA不影响递送的结果。所以荧光素酶mRNA的组织表达可以反映由相同LNP递送的mRNA的生物分布结果。检测手段为在体生物发光法，为活体成像法的一种。右图为莫德纳mRNA-1273申报资料中呈现的生物分布结果，同样也是采用LNP包裹替代mRNA进行研究，检测手段为bDNA法。比较这两个上市mRNA疫苗的生物分布结果可以看出，活体成像法研究组织分布的检测灵敏度和精细化程度不足。此外，活体成像法不同于常规生物分析方法，无法进行分析方法学验证。
图4. 上市mRNA疫苗的生物分布研究[3]
案例2：mRNA治疗药物的吸收和分布研究
NTLA-2001为LNP同时包裹编码Cas9蛋白mRNA和sgRNA，发挥基因编辑作用的mRNA治疗药物，目前处于临床I期。该药物的临床前数据显示，小鼠静脉注射NTLA-2001后，检测了小鼠血浆和肝脏组织中两条mRNA链的浓度，同时检测了肝脏中阳离子脂质的浓度。PD相关的指标，检测了基因编辑率和血清PD marker的浓度。血浆和肝脏中mRNA的浓度在给药后24小时明显下降，肝脏中阳离子脂质的浓度在给药后48小时下降到较低的水平。而基因编辑率和PD marker浓度显示药效有一定的滞后性，给药后168小时达到最大药效。
图5. NTLA-2001在CD-1小鼠体内的PK和PD研究[4]
案例3：mRNA与蛋白的生物分布比较
mRNA的分布和蛋白的分布是否完全一致呢？下图由3种不同的阳离子脂质组成的LNP递送mRNA，研究mRNA与其编码的蛋白在不同组织中分布。结果显示，mRNA的分布和蛋白分布并非完全一致，尤其最后一个案例中，mRNA分布最高的组织为肝脏而相应蛋白表达最高的组织是肺。从mRNA到蛋白表达存在翻译效率的问题，不同组织的翻译效率可能并不相同。mRNA的生物分布，需要综合mRNA和蛋白的生物分布结果进行分析。尤其对于mRNA治疗药物而言，编码蛋白在靶组织的表达量和表达时间影响药效的产生和持续。mRNA疫苗所采用的替代mRNA方法进行生物分布研究可能并不适用于mRNA治疗药物。
图6. mRNA与其编码蛋白在不同组织中分布[5]
四、mRNA药物临床前药代动力学评估策略
针对mRNA药物的临床前药代动力学研究，可分为针对mRNA疫苗，mRNA治疗药物和新型辅料三部分的研究。
- mRNA疫苗需要开展生物分布研究，可以采用传统的组织摘取法，也可参考上市mRNA疫苗采用活体成像法，使用相同LNP包裹的替代mRNA进行生物分布研究是可行的。
- mRNA治疗药物需要开展药代动力学和生物分布研究。血浆药代动力学研究可检测mRNA、编码蛋白、免疫原性及疾病相关的生物标志物等，需根据药物作用机理、实验目的以及检测的难易程度具体分析。生物分布可先考察mRNA的分布，根据mRNA分布结果选择相应靶组织或关键组织进一步研究编码蛋白或生物标志物在关键组织中的浓度。
- 新型辅料的研究包含体外、体内和药物相互作用研究。体外研究包含各种体系的代谢稳定性和代谢产物鉴定，体内研究包含动物的吸收、分布、代谢和排泄研究，以明确表征该辅料的体内过程。新辅料的药物相互作用，视风险程度进行考察。一般而言，mRNA疫苗的给药频次低，给药间隔长，新辅料的药物相互作用风险较小；但对于需要长期重复给药的mRNA治疗药物，建议针对新辅料开展药物相互作用评价。
图7. mRNA药物的临床前药代动力学评估策略
结语
为评价mRNA药物的药代动力学性质，药明康德DMPK部门建立了针对mRNA药物的一体化生物分析平台，包含针对血浆或组织mRNA浓度检测的qPCR，bDNA方法；针对递送载体的质谱检测方法；针对翻译后蛋白的LBA等检测方法，还有针对生物标记物检测，免疫原性分析，放射性分析等平台，满足不同mRNA药物药代动力学研究的需求。值得一提的是，目前并没有针对mRNA分析的qPCR分析方法法规可供参考，我们参考Global CRO Council in Bioanalysis (GCC)给出的qPCR方法验证的共识内容，制定了我们的内部标准。我们对于mRNA药物一体化分析平台的建立以及mRNA药物药代研究的经验总结，希望进一步帮助客户缩短mRNA药物的研发周期。
图8. 针对mRNA药物的一体化生物分析平台
药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。
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参考文献：
[1] Barbier AJ, Jiang AY, Zhang P, Wooster R, Anderson DG. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nat Biotechnol. 2022 Jun;40(6):840-854. doi: 10.1038/s41587-022-01294-2. Epub 2022 May 9. PMID: 35534554.
[2] Rohner E, Yang R, Foo KS, Goedel A, Chien KR. Unlocking the promise of mRNA therapeutics. Nat Biotechnol. 2022 Nov;40(11):1586-1600. doi: 10.1038/s41587-022-01491-z. Epub 2022 Nov 3. PMID: 36329321.
[3] BNT162b2, Module 2.4. Nonclinical Overview.
[4] Finn JD, Smith AR, Patel MC, Shaw L, Youniss MR, van Heteren J, Dirstine T, Ciullo C, Lescarbeau R, Seitzer J, Shah RR, Shah A, Ling D, Growe J, Pink M, Rohde E, Wood KM, Salomon WE, Harrington WF, Dombrowski C, Strapps WR, Chang Y, Morrissey DV. A Single Administration of CRISPR/Cas9 Lipid Nanoparticles Achieves Robust and Persistent In Vivo Genome Editing. Cell Rep. 2018 Feb 27;22(9):2227-2235. doi: 10.1016/j.celrep.2018.02.014. PMID: 29490262.
[5] Zadory M, Lopez E, Babity S, Gravel SP, Brambilla D. Current knowledge on the tissue distribution of mRNA nanocarriers for therapeutic protein expression. Biomater Sci. 2022 Oct 25;10(21):6077-6115. doi: 10.1039/d2bm00859a. PMID: 36097955.
作者：马利萍，刘欢，金晶
编辑：方健，钱卉娟
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