上市mRNA疫苗临床前药代动力学数据解读

2020年12月FDA紧急批准了两款针对新冠病毒SARS-CoV-2的mRNA疫苗，分别是BioNTech/Pfizer的BNT162b2（COMIRNATY^®）和Moderna的mRNA-1273（SPIKEVAX^®）。随着这两款mRNA疫苗的上市，以mRNA作为预防和治疗手段的管线越来越多，研究逐渐趋于白热化。

mRNA疫苗的原理是将病毒的mRNA在体外修饰后递送至机体细胞内，表达产生的抗原蛋白可以刺激机体产生针对该抗原的免疫应答，扩大机体的免疫能力。相比传统疫苗，mRNA疫苗生产工艺简单、开发速度快、无需细胞培养，整体研发成本较低，体现出非常明显的优势。与DNA疫苗相比mRNA疫苗也具有更高的安全性，因为mRNA在细胞质核糖体中被整合表达，无需进入细胞核，没有整合至宿主基因组导致基因突变的风险。然而，mRNA疫苗加速研发的过程中也伴随着越来越多的疑问，比如对于mRNA疫苗，是否需要在临床前研究其药代动力学性质，如何研究，结果又是怎样的。本文将通过对已上市两款疫苗临床前数据的解读，为mRNA疫苗的研发提供参考。

BNT162b2和mRNA-1273的临床前药代动力学研究均可以归纳为两个部分：一是针对mRNA进行的生物分布研究；二是针对新型脂质成分进行的动物体内药代动力学、组织分布、排泄和代谢研究。这两个部分分别对应了mRNA疫苗本身以及疫苗使用的LNP递送系统。对mRNA进行的研究主要是基于FDA疫苗开发和许可指导原则中明确提出当疫苗包含新颖结构且现有平台技术没有可支持的生物分布数据时需考虑在动物上进行体内生物分布研究^[1]。而对于LNP递送系统，可以参考《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则》中提到的，对于全球均未用过的递送物质，应参照《新药用辅料非临床安全性评价指导原则》进行详细的研究，即按照临床相关的给药途径，以与非临床安全性评价中相同的动物种属来研究辅料的吸收、分布、代谢和排泄^[2,3]。

一、BNT162b2的临床前药代动力学数据解读

根据公开文献信息整理，BNT162b2的临床前药代动力学研究内容可总结如下：

表1. BNT162b2的临床前药代动力学研究总结

BNT162b2 mRNA生物分布研究^[4]

BNT162b2 mRNA的生物分布采用活体成像法进行研究。小鼠的两条后肢分别肌肉注射LNP包裹荧光素酶（Luciferase）modRNA，给药6小时后注射部位和肝脏中均检测到荧光。肝脏中荧光表达量相对较低且给药后48小时无法检测到荧光，而注射部位的荧光持续时间更长，小鼠全身总荧光量于给药后第9天降低至基线水平。由于荧光成像法灵敏度和精细程度的限制，无法准确量化每个组织或部位的荧光分布，即RNA的分布。

图1. BNT162b2 mRNA小鼠体内分布

（左图为小鼠全身活体成像图，圈出部位为小鼠两条后肢上的给药部位；右图为小鼠总荧光定量结果）

ALC-0315和ALC-0159的大鼠体内药代动力学研究^[4]

ALC-0315和ALC-0159是BNT162b2 的LNP递送系统中使用的两种新型脂质分子。ALC-0315是一种阳离子脂质，可以调控mRNA进入细胞后的内含体逃逸过程。ALC-0159是一种PEG修饰脂质，能够在空间上形成一个包裹mRNA的亲水层，有利于RNA的稳定储存、减少与蛋白的特异性吸附。

同样采用LNP包裹荧光素酶modRNA对两个脂质分子的大鼠体内药代动力学进行研究，modRNA剂量1mg/kg时相当于大鼠分别给药15.3mg/kg的ALC-0315和1.96 mg/kg的ALC-0159。静脉注射后，ALC-0315和ALC-0159从血中快速分布到肝脏，血中药时曲线相似，肝脏中ALC-0315的暴露远远高于ALC-0159，呈现长时间的肝脏分布。与给药剂量相比，ALC-0315的肝脏分布约占60%，ALC-0159的肝脏分布仅为20%。给药2周后，ALC-0315和ALC-0159的血药浓度分别下降约7000倍和8000倍，而肝脏中ALC-0315和ALC-0159的浓度则分别下降约4倍和250倍以上。ALC-0159在血液和肝脏中的末端消除半衰期约2~3天，ALC-0315为6~8天。

此试验中同时对两个脂质的尿粪排泄进行了研究。尿液中未检测到ALC-0315和ALC-0159，粪便中ALC-0315和ALC-0159的排泄率分别为1%和50%。两种脂质成分的排泄回收率均不足，说明其在体内存在一定程度的代谢清除。

图2. ALC-0315和ALC-0159在大鼠血浆（左）和肝脏（右）中的药时曲线

表2. ALC-0315和ALC-0159在大鼠中的PK

BNT162b2 LNP体内分布研究^[4]

BNT162b2 LNP的体内分布通过同位素试验进行表征。实验中使用的LNP添加了痕量的放射性[³H]-CHE，该脂质标记物不会和细胞脂质发生交换，也不会被代谢，常用于脂质的代谢和摄取等研究。雌雄大鼠肌肉注射包裹了荧光素酶modRNA的这种LNP后，注射部位的放射性水平始终最高。除给药部位以外，在血浆和大部分组织中也检测到一定的放射性，且给药后1~4小时内血浆分布高于组织分布。给药后48小时内，LNP主要分布在肝脏、肾上腺、脾脏和卵巢，T_max在给药后8~48小时范围内。LNP在大鼠体内的分布没有明显的雌雄差异，除给药部位以外，LNP在大鼠体内不同组织的雌雄总回收率（%给药剂量）由高到低依次是：肝脏（18%）>> 脾脏（≤1.0%）> 肾上腺（≤0.11%）≈ 卵巢（≤0.095%），提示该递送系统有明显的肝靶向性。

ALC-0315和ALC-0159的体内外代谢研究^[4]

ALC-0315在体内和体外孵育系统中均检测到了酯键水解后的四种代谢产物，在体内水解产物会进一步与葡萄糖醛酸结合，综合体内外代谢产物判断ALC-0315主要的代谢途径是水解和葡萄糖醛酸结合。ALC-0159主要的代谢途径为酰胺键水解生成N,N-ditetradecylamine。两个脂质的水解代谢在四个种属（人、大鼠、小鼠、猴子）的基质中均存在。ALC-0315和ALC-0159的生物转化途径如图3和图4所示。

图3. ALC-0315可能的生物转化途径

图4. ALC-0159可能的生物转化途径

二、mRNA-1273的临床前药代动力学数据解读

01 mRNA-1273 mRNA的生物分布^[5]

Moderna在申报mRNA-1273疫苗上市时使用了mRNA-1647的相关生物分布数据，而没有直接对mRNA-1273进行研究。两者的差别包括两个方面，首先mRNA-1273包含一条编码全长SARS-CoV-2 S-2P蛋白的mRNA，mRNA-1647包含6条mRNA，分别编码全长CMVgB和gH/gL/UL128/UL130/UL131A 五聚体糖蛋白；另外，两个疫苗使用的LNP递送系统具有相同的脂质成分，但mRNA-1273的脂质纳米颗粒略小于mRNA-1647。目前还无法确定纳米颗粒的大小是否会显著影响mRNA的组织分布，但Moderna认为两个纳米颗粒的直径均小于大鼠肝窦内皮细胞上的孔径（161nm），推测纳米颗粒大小的差别对于LNP递送的肝脏分布影响较小。

mRNA-1647的组织分布在雄性SD大鼠上开展。大鼠经肌肉注射100μg 的mRNA-1647，给药2小时后大部分组织都检测到了mRNA，包括脑、心脏、肺、眼球和睾丸。组织达峰时间在给药后2~24小时，且组织暴露量均高于血浆暴露量。与BNT162b2类似，mRNA-1647显著的肝脏分布证实了LNP递送系统的肝靶向特征。另外，mRNA-1647在给药部位、淋巴结、脾脏和眼部的浓度也均超过血浆浓度。

mRNA-1647在血浆中快速消除，半衰期仅2.7~3.8小时，但在组织中消除速率明显降低。给药部位、腘窝近端淋巴结、腋窝远端淋巴结以及脾脏中6个mRNA的平均半衰期分别为14.9、34.8、31.1和63.0小时，其他组织在给药3天后mRNA含量低于最低检测限，脑组织中mRNA 的T_last约为给药后25小时。

除了以上mRNA-1647的大鼠组织分布数据，在针对mRNA-1273开展的毒理试验中也同时对组织中的mRNA浓度进行了检测。除肾脏外，其他组织中均检测到了低浓度的mRNA，包括肝脏、心脏、肺脏、睾丸和脑，其中脑组织中mRNA浓度约为血中浓度的2%~4%，说明LNP递送的mRNA可以在一定程度上穿过血脑屏障分布到脑中。

02 mRNA-1273 脂质分子的PK、分布、代谢和排泄^[5]

mRNA-1273的LNP系统中包含两个新型脂质分子SM-102和PEG2000-DMG，结构如图5所示。

图5. SM-102和PEG2000-DMG的分子结构

Moderna没有专门对SM-102的分布、代谢和药动学进行研究，但在申报资料中结合其结构类似物SM-86的数据对该类结构的体内分布、代谢和排泄特征进行了讨论。生物分布方面，SM-86的体内分布和对应LNP递送的mRNA是一致的。SM-86在体内可经酯键水解被快速代谢，产生的脂肪酸代谢物可以通过胆汁和肾脏快速排泄。另外，定量全身放射自显影(QWBA)结果显示SM-86及其代谢物在所有组织中的暴露均不超过168小时。综合这些结果认为重复给药后SM-102不会在体内大量蓄积，由此预测阳离子脂质SM-102产生毒性的可能性较小。

三、mRNA疫苗的药代动力学特征总结

• mRNA的生物分布特征取决于所使用的LNP递送系统，参考上市疫苗的申报资料， FDA可以接受使用相同LNP包裹替代RNA开展mRNA疫苗组织分布研究。

• 肌肉注射mRNA疫苗后，mRNA血液暴露量低于组织暴露量，在注射部位会有一个长时间的持续分布，而LNP本身的肝靶向性则决定了mRNA在肝脏中有较高的暴露。此外，淋巴结和脾脏作为免疫器官也具有一定的分布，需要在研究中重点关注。整体而言，mRNA在绝大多数组织中分布和消除均很迅速，基本上给药后24小时之前可以达峰，给药后72小时内消除完全。但需注意mRNA在注射部位、淋巴结和脾脏中可能持续分布2~3周的时间，消除速率较慢。

• LNP递送系统的组成成分中，磷脂和胆固醇属于体内天然存在的内源性脂质，不需要评估其药代动力学性质。而阳离子脂质和PEG脂质作为外源性的成分，考虑到进入体内后机体对其处置过程，以及它们可能产生的毒性和免疫原性是未知的，需要评估其吸收、分布、代谢和排泄的过程。

• 结合BNT162b2和mRNA-1273递送系统中几个脂质分子的结构特征和研究结果，脂质分子在体内均可以发生不同程度的水解代谢，水解程度和其结构相关。排泄试验结果显示尿液、粪便和胆汁中脂质分子原型的回收率通常是不足的。脂质的组织分布和mRNA相对一致，在注射部位的分布是最多的，分布时间也最长，其次是肝脏（LNP靶组织）以及脾脏和淋巴结等免疫组织。

结语

本文通过对BNT162b2和mRNA-1273临床前药代动力学数据进行解读，在有限的数据基础上对LNP递送mRNA疫苗的药代动力学特征进行了总结，为mRNA疫苗的临床前研发提供了一些思路和依据。此外，药明康德DMPK部门建立了一体化生物分析平台，包含针对mRNA血浆和组织检测的qPCR，bDNA方法及针对递送载体的质谱检测方法等，结合我们丰富的药代动力学研发经验，期待助力客户快速推进mRNA疫苗和药物的项目进程。

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作者：刘欢，马利萍，金晶

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹