盒式给药的优劣势及分析挑战

在临床前药代动力学（PK）研究中，盒式给药（cassette dosing）^[1]是一种常见的用于快速筛选的给药方法。盒式给药指在单次实验中，将多个化合物（通常为2-6个，有时更多）配制成混合给药溶液，通过静脉注射或口服等方式低剂量给予同一动物（通常是啮齿类）^[2]。目的是在单次实验中收集多种化合物的药代动力学数据，而无需分别开展多个单独的PK研究。盒式给药在动物实验、样品制备、仪器利用等各个环节具有显著优势，但也会给分析带来挑战：如化合物间的干扰、稳定性不同、极性差异大、灵敏度差异大等。本文旨在系统探讨多化合物盒式给药的优劣势、挑战及样品分析策略，为相关研究提供参考。

盒式给药的优势与劣势

与常规给药方式相比，盒式给药在临床前药代动力学研究中的各环节均有不同，图1对比了常规给药与盒式给药五种化合物在制剂配制、动物实验、样品制备、进样分析、数据处理及报告书写的流程区别。

图1. 常规给药(a)与盒式给药(b)五种化合物在PK实验的对比示意图^[3]

如图1a，完成5个化合物的大鼠体内PK实验需要分别配制五个不同制剂，每个制剂中含有一个化合物（A、B、C、D和E），使用5只大鼠，分别从每只大鼠采集血液样本，并通过LC-MS/MS分析不同时间点的体内药物浓度。以每只动物8个时间点为例，至少使用5个分析方法，通过5个分析批次共分析40个血浆样品，大鼠间的个体差异可能会影响到PK参数的横向对比。

盒式给药如图1b，将5个不同化合物混合配制成单一制剂。在选定的时间点，仅从一只大鼠上采集血液样本，通过LC-MS/MS对五种化合物同时检测后进行PK参数计算，可消除大鼠个体差异带来的影响。

在体内PK筛选实验中，对比5个不同化合物的盒式给药和常规给药方法，盒式给药可大幅提高各环节工作效率（图2）：

图2. 盒式给药与常规给药对比效率图

盒式给药的优劣势如下表（表1）。

表1. 盒式给药的优势与劣势

盒式给药的挑战及分析策略

在PK实验的样品分析中，多化合物合并分析可显著缩短分析周期。然而，盒式给药同时也为分析带来了独特的挑战，需针对性解决：

化合物间干扰

挑战核心

盒式给药通常会将结构相似或理化性质相近的多个化合物放在一组，以便于配制与给药。但同时，结构相似的多个化合物可能会存在相同或相近的子离子碎片（m/z），使得它们在质谱上难以区分，存在干扰。例如多化合物的精确质量差距≤4 Da时，在LC-MS/MS分析中很可能存在干扰。

分析策略

盒式给药分析前需要先考察化合物间干扰。如阿替洛尔（atenolol）与美托洛尔（metoprolol）盒式给药，两个化合物的m/z仅相差1 Da，极大可能存在干扰。分别进样每个化合物的纯溶液，并打开所有化合物的离子通道，观察化合物出峰时间，以及其他化合物的离子通道是否能监测到特征峰，如果均没有监测到特征峰，则化合物间没有干扰，可以进行下一步分析工作；如果观测到待测物特征峰，则化合物间存在干扰，需要采用调整液相梯度、更换色谱柱等方法，确保化合物间干扰被消除，方可继续分析。

总结

在多个化合物合并分析前，准确评估并消除化合物间的干扰（包括共洗脱、质谱交叉干扰、离子抑制/增强）是保证数据可靠的关键点。PK分析中存在干扰时，需要调整液相方法、更换色谱柱使化合物达到基线分离，若干扰无法消除，则不能盒式给药。

化合物的稳定性

挑战核心

在化合物储存、运输，及采集样品后分析前的各个环节中，化合物可能受到环境、温度、酶等因素的影响，从而发生转化，影响分析准确性。在配制化合物前，需要考察不同化合物的稳定性。如果不稳定，需要添加相应的稳定剂后再进行样品分析。 

分析策略

盒式给药分析前需充分考虑每个化合物的稳定性，包括且不限于化合物储备液、工作液、基质、真实样品、上清等的稳定性。以阿司匹林（aspirin）与水杨酸（salicylic acid）盒式给药为例，阿司匹林在存储过程中极易转化为水杨酸，影响分析结果，分析前需要分别考察每一个环节的稳定性。结果表明阿司匹林在血浆样品中极不稳定，需要在采样前加入氟化钠作为稳定剂，并全程低温快速操作^[5]。使用相同条件考察水杨酸的稳定性，确保各化合物都稳定后，才能进行联合分析。

总结

盒式给药中，需保证样品在采集、储存及分析过程中的稳定性。多化合物的分析需要充分考虑到每个化合物的稳定性，如化合物不稳定，可添加酶抑制剂、抗氧化剂等试剂，使各化合物均保持稳定（更多有关化合物稳定性的内容，参考文章：生物基质中分析物不稳定的原因及解决策略）。

化合物极性差异大

挑战核心

盒式给药中，各化合物极性有时存在很大差异，单一的洗脱条件难以在合理的时间实现所有化合物的良好分离和尖锐峰形。但实际大小鼠实验的样品体积通常不足以分开多次分析，需要优化前处理及分析方法，满足各个化合物合并分析。

案例解析

• 问题：

  替诺福韦（tenofovir）、艾米替诺福韦（tenofovir amibufenamide）在小鼠中盒式给药，每只动物连续采点，单个样品体积仅有10微升。两种药极性差异大，保留情况如下图（图3）。

图3. 替诺福韦与艾米替诺福韦质谱图

a) 艾米替诺福韦极性极小，较难洗脱，使用C18色谱柱保留强且时间靠后；

b) 替诺福韦极性大，使用C18色谱柱无保留。

• 解决方法：

1）考虑到替诺福韦极性大，可将乙腈沉淀剂更换为甲醇沉淀剂，减少溶剂效应；

2）将5 cm C18色谱柱更换为10 cm T3色谱柱，并调节液相方法拉长梯度，从而有效保留和分离两个药物，实现同时分析（图4）。

图4. 调整方法后的替诺福韦与艾米替诺福韦质谱图

总结

当盒式给药中的各化合物极性差别很大时，需要改进前处理方法，更换亲水性相互作用的色谱柱（HILIC）或者宽极性范围的色谱柱。若以上方式均无法解决，可考虑采用双色谱柱串联分析。

化合物灵敏度差异大

挑战核心

盒式给药中，不同化合物的结构、离子化效率等因素可能会导致化合物响应存在数量级差异。对于响应低的化合物，很难检测到消除相的样品浓度。

案例解析

• 问题：

  别孕烷二酮（allopregnanedione）与别孕烯醇酮（brexanolone）盒式给药，方法开发初期，别孕烷二酮响应异常低，比别孕烯醇酮响应低10倍。

• 解决方法：

  1）改变调谐方式，先通过色谱柱富集别孕烷二酮，找到母离子Q1 [M+H]＋替代 [M+H-H2O]＋特征峰，别孕烷二酮响应提高；

  2）筛选多个色谱柱，最终选用C4 色谱柱，同时增大进样量，药物保留增强且响应进一步提高；

  3）调节流动相pH值，将流动相FA浓度由0.1%降低为0.02%，两个化合物响应均显著提高近10倍；

  4）优化质谱CUR参数，调低离子源温度，最终别孕烷二酮响应提高100倍，与别孕烯醇酮联合分析，线性范围均定为3.00 ng/mL-3000 ng/mL。

调整方法前后的对比如下（表2）。

表2. 调整方法前后的药物峰面积对比

总结

盒式给药分析中，当化合物响应出现数量级差异时，可以通过优化前处理、提升离子化效率、更换色谱柱、优化液相方法及质谱参数等方法来调整化合物响应。

结语

在临床前药代动力学研究中，盒式给药策略显著提升了药物开发效率，并为探索个体化治疗方案提供了重要支持。药明康德DMPK积累了丰富的临床前盒式给药经验，能够助力客户：

1. 科学筛选化合物组合：基于药代动力学特性（如互补性、代谢途径），合理选择联合给药的化合物；

2. 优化实验设计：设计高效、可靠的给药研究方案，最大化数据产出价值；

3. 开发稳定分析方法：提供稳定可靠的多化合物生物分析方法（如干扰、稳定性、极性差异、灵敏度差异）；

4. 广泛应用于早期筛选：大幅提升筛选效率，在抗癌、抗菌及免疫抑制剂等领域的早期药物筛选中应用广泛，有助于快速识别活性候选分子，加速研发进程。

药明康德DMPK已有近20年盒式给药经验，涵盖从制剂到分析等各环节，并借助先进的分析仪器，实现高通量和高效率的生物分析，满足客户的分析要求，为加速化合物向临床转化提供关键支持，助力药物研发进程。

图5. 药明康德DMPK分析平台

作者：李彤，陈丹，吴睿，王玥，高峥贞，卢金莲，张玲玲

编辑：富罗娜·克里木，钱卉娟

设计：张莹莹

药明康德DMPK依托中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1800个新药临床研究申请（IND）。

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