Branched-DNA和RT-qPCR分析平台在mRNA药物生物分析中的比较

近年来，由于生物技术的快速发展，利用mRNA作为治疗药物生产人体中几乎所有的功能性蛋白质成为可能^[1]。在预防和治疗多种疾病领域，基于mRNA的疫苗/治疗性药物拥有广阔的发展前景，目前正在进行的mRNA疫苗/治疗性药物研究管线数量也在逐步增加。为了更好地了解mRNA疫苗/治疗性药物的药效和安全性，特别是药代动力学（PK）、毒代动力学（TK）、组织分布和药效学（PD）的研究，准确地定量系统循环和不同组织中的mRNA药物水平变得尤为重要。

RT-qPCR平台被广泛认为是定量mRNA的黄金标准，最近，Branched-DNA（bDNA）平台成为热门，为RT-qPCR平台提供了独特补充。本文将以Sprague Dawley大鼠血浆中的模拟LNP-mRNA治疗性药物为例，通过比较其在RT-qPCR和bDNA两个平台上的生物分析方法验证性能，为计划进行治疗性mRNA生物分析的研究人员提供实践经验。

RT-qPCR和bDNA方法介绍

PCR是一种基于酶扩增的检测方法，广泛应用于分子生物学研究和诊断。PCR可通过短互补引物探针，在多个热循环中（通常为40-45个循环）扩增逆转录自mRNA的cDNA模板。SYBR green染料（插入双链DNA产物）或TaqMan荧光探针（在创建子拷贝时切割并释放荧光报告基团）是检测和定量扩增DNA产物的两个主要系统。基于PCR的方法已广泛用于mRNA疫苗/药物的PK和生物分布研究，包括对癌症疫苗中编码抗原的mRNA的定量、对人血浆和特定组织中COVID-19疫苗mRNA（mRNA-1273或BNT162b2）的定量。为了评价mRNA-1273和BNT162b2疫苗mRNA穿过血乳腺屏障和血胎盘屏障的能力，可通过qPCR方法对乳汁和胎盘外植体中的mRNA浓度进行定量。

多年来，学术实验室一直使用bDNA对长链核酸进行定量，目前已广泛用于HIV、HCV和HBV感染的病毒载量定量。该试验利用定制的捕获、阻断和Z延伸探针与靶mRNA序列的大片段杂交结合，扩增探针能特异性识别双Z延伸探针，并使用检测试剂对信号进行扩增。bDNA检测试剂盒可用于定制板或基于微珠的检测形式。该技术被用于评价大鼠中COVID-19 mRNA疫苗（mRNA-1647）的组织分布和小鼠中含有编码血凝素的mRNA的流感疫苗的组织分布。两种方法的原理如图1所示。

图1. RT-qPCR和bDNA方法原理示意图^[2]

RT-qPCR和bDNA定量方法性能和验证参数比较

bDNA和RT-qPCR平台对血浆中LNP-mRNA的定量有方法学性能的差异。由于血浆中内源性mRNA含量很低，RT-qPCR检测样品预处理使用直接裂解法，再进行逆转录和qPCR步骤。bDNA检测使用的是基于测量内源性mRNA曾用方法的修改。具体两种方法的流程如图2所示。

图2. RT-qPCR方法和bDNA方法对血浆中的LNP-mRNA（EGFP mRNA）进行定量分析实验流程图

本次实验使用商品化的LNP-mRNA（编码EGFP）进行测试，用于RT-qPCR的引物和探针由Primer-blast软件设计。正向引物序列为GAGCGCACCATCTTCTTCAA，反向引物序列为TGATGCCGTTCTTCTGCTTG。TaqMan探针序列为用5'Fam-3'Tamra标记的ACAAGACCCGCGCCGAGGTG。对于bDNA检测，使用商品化的QuantiGene^TM试剂盒和B-DNA EFGP探针组，孵育温度校准使用QuantiGene™温度验证试剂盒。经过评估各方法的灵敏度、检测范围、批内和批间准确度和精密度、抗内源性mRNA干扰能力、选择性和稳定性^[3,4]。比较了以下各参数性能。

灵敏度参数

RT-qPCR方法的定量下限（LLOQ）为1pg/mL。bDNA方法的LLOQ为2pg/mL。从定量范围看，RT-qPCR有较宽的线性范围，从1pg/mL到1ug/mL（一百万倍），而相较基于化学发光（Chemiluminescence）的原理，bDNA方法的定量范围要窄很多，从2pg/mL到250pg/mL，并且采用逻辑回归（Logistic Regression）的拟合方式。两种方法的标准曲线如图3所示。

图3. 图A为RT-qPCR扩增和定量标准曲线示意图。左图X轴为qPCR循环数；Y轴为ΔRn值。曲线表示从STD01到STD07的标准样品（对应浓度如右图所示）；右图是RT-qPCR定量标准曲线。X轴从右到左表示STD01-STD07样品浓度（pg/mL）；Y轴为qPCR循环ct值。

图B为bDNA定量标准曲线，X轴从左到右代表STD01-STD08样品浓度（pg/mL），Y轴为相对光单位（RLU）值。

批内/批间准确度和精密度

如图4所示，评估RT-qPCR和bDNA方法时，每个run都有1组标准样品（STD）和3组5个不同浓度的质控（QC）样品。其中RT-qPCR方法标准曲线样品浓度设置为1x10⁶、1x10⁵、1x10⁴、1x10³、1x10²、1x10¹、1x10⁰pg/mL；质控样品浓度设置为1x10⁶、5x10⁵、5x10³、5x10¹、1x10⁰pg/mL。bDNA方法标准曲线样品浓度设置为250、212.5、100、40、16、8、4、2pg/mL；质控样品浓度设置为250、200、30、6、2pg/mL。

从以上评估可以看出，bDNA方法有更好的精密度和准确度。一般bDNA方法的%CV和%Bias小于10%。而RT-qPCR方法的%CV和%Bias要高得多，尤其是在较低浓度范围。bDNA方法的质控样品（ULOQ、HQC、MQC、LQC、LLOQ）总误差（%CV加上|%Bias|）分别为2.8%、4.4%、6.5%、6.7%和7.1%。相比之下RT-qPCR方法的质控样品总误差分别为19.6%、22.5%、19.5%、30.2%和35.6%。

图4. A-D为RT-qPCR方法三个分析批标准曲线样品/质控样品的精密度和准确度的%CV和%Bias，3个分析批的平均值用横线表示。E-H为bDNA方法三个分析批标准曲线样品/质控样品的精密度和准确度的%CV和%Bias，3个分析批的平均值用横线表示。

抗内源性mRNA干扰能力

通过评估实验发现，RT-qPCR方法可以耐受更高水平的内源性mRNA干扰。该实验将不同浓度的SD大鼠肝组织纯化的mRNA，通过人为方式加入bDNA或RT-qPCR反应体系中。由干扰情况分析可知，RT-qPCR方法的HQC/LQC样品可以耐受高达25ug/反应的内源性mRNA浓度。而bDNA方法的耐受性较差，1ug/反应mRNA已经可以抑制信号，如图5所示。

图5. 内源性mRNA对于RT-qPCR和bDNA方法高浓度QC和低浓度QC样品的信号抑制水平。X轴表示加标内源性mRNA/反应的量，Y轴表示回收率。未加入内源性mRNA样品视为1（100%）。

选择性参数

两种方法在不同浓度（ULOQ、HQC、LLOQ）的雌雄SD大鼠共10个不同个体血浆中，均表现出良好的选择性。RT-qPCR方法中，100%的ULOQ/HQC样品及94%的LLOQ样品通过了选择性评价。bDNA方法中，所有样品均通过了选择性评价。

稳定性参数

两种方法在不同条件下对测试样品均显示出良好的稳定性，包括五次冻融循环、室温孵育6小时和4℃孵育24小时。稳定性样品与基线样品之间的|%Bias|均小于20%（RT-qPCR为30%）。

小结

综上所述，bDNA和RT-qPCR平台对血浆中LNP-mRNA定量上方法学性能比较结果如下：

1. 通过优化分析方法，bDNA方法可以实现与RT-qPCR方法（1pg/mL）相当的定量下限（2pg/mL），但测定范围较窄（bDNA为2-250pg/mL，而RT-qPCR的线性范围为1x10⁶）。

2. 与RT-qPCR方法相比，bDNA方法在准确度和精密度评估方面具有优势，可以满足LBA平台的法规接受标准。

3. bDNA方法对内源性mRNA干扰的耐受性较低。相比血浆来说，组织样本的内源性mRNA较多，不同组织差异较大，因此这种方法对于组织样本生物分析的考量点更多。

4. 两种方法具有相当的选择性和稳定性性能。

5. 引物/探针设计和优化对两种方法都至关重要，正确的设计可以显著提高检测性能。

结语

理论上，mRNA疫苗/治疗药物可以通过核糖体表达系统翻译成任何蛋白/肽段。相对于基于DNA的基因治疗药物，mRNA药物因为无需进入细胞核发挥疗效，其转染效率相对更高且毒性更低，更重要的是其没有潜在插入诱变或感染的风险，无需担心因非靶DNA序列被修改而造成的脱靶毒性。并且相对于传统蛋白疗法，mRNA药物可以持续翻译成编码的蛋白质，具备更好的药效和潜力。通常mRNA药物由于载体、表达蛋白、免疫原性等特性，其ADME有效性以及安全性的研究内容相对更加复杂，涉及到的生物分析平台和策略也更多。

药明康德DMPK具备丰富的临床前生物分析经验，目前已承接几十个mRNA疫苗/药物的生物分析项目，积累了丰富的分析经验，可以帮助客户快速完成临床前生物分析方法的建立和验证，满足药代动力学的FDA/NMPA/TGA的IND申报要求。目前药明康德DMPK建立的mRNA药物整合性生物分析平台，可以帮助mRNA药物开发者在不同的研究阶段更加高效/准确地评估药物体内外的ADME特征和组织分布，更好地理解其药效与安全性之间的关系，为后续的安全性评价和临床研究打下坚实的基础。

作者：周毛天，颜欢，宋苗苗，邢丽丽

编辑：富罗娜·克里木，钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹

药明康德DMPK依托中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1700个新药临床研究申请（IND）。

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