自20世纪60年代以来，胰高血糖素样肽-1（GLP-1）因其在人体内的广泛生理效应而备受关注。围绕GLP-1开发的多肽药物，除了单靶点的受体激动剂（例如司美格鲁肽）以外，多靶点激动剂的研发进展呈现出令人瞩目的趋势，例如双靶点GLP-1和GIP的受体激动剂替尔泊肽，在肥胖症领域的临床疗效[1]受到广泛关注。目前已有多个三靶点受体激动剂进入临床。
2024年12月CDE发布《重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂药学研究与评价技术指导原则（征求意见稿）》，将GLP-1受体激动剂分为3类：GLP-1短肽突变体，如贝那鲁肽；化学修饰的GLP-1受体激动剂，如利拉鲁肽、司美格鲁肽、聚乙二醇洛塞那肽等，以及与蛋白（抗体、Fc段或白蛋白等）偶联或融合表达的GLP-1受体激动剂[2]。目前上市的经化学修饰的GLP-1受体激动剂多采用脂肪酸链修饰[1]，借助脂肪酸与人血清白蛋白（HSA）结合，将浓度高且稳定的HSA作为药物的循环储库，可以延长药物的半衰期[3]。
放射性示踪技术为研究多肽药物的吸收、分布、代谢、排泄（ADME）[4]提供了强有力的工具，具有特异性强、稳定性好、灵敏度高、应用广泛等优点。本文将重点介绍经脂质化修饰的GLP-1受体激动剂的放射性同位素标记合成策略及ADME研究关键考量。
GLP-1多肽药物放射性标记合成
GLP-1多肽药物的放射性标记合成，需要综合考虑给药剂量、放射性核素、标记位点、标记个数以及合成路线等因素。
标记位点和标记个数的考量
放射性核素的选择，可以参考文章37款已上市多肽药物ADME研究总结及放射性研究考量。对于GLP-1多肽药物，14C是比较推荐的放射性标记核素。
选择放射性标记的位置至关重要。引入放射性标记，应能够示踪重要生物转化途径或循环代谢产物。目前，经脂质化修饰的GLP-1多肽药物进行放射性标记时的首选位点为脂质部分及其与氨基酸连接片段[6-8]。
GLP-1多肽药物的分子量一般为3000~6000 Da，其体内给药剂量较低，已上市的GLP-1多肽药物在临床前动物的给药剂量为0.15~3 mg/kg，如果标记一个碳原子（比活度约45~55 mCi/mmol），通常不能满足物质平衡和放射性代谢物谱研究的定量需求，因此，较多采取标记多个碳原子的策略，比如替尔泊肽[6]，标记4个碳原子。
GLP-1多肽药物多位点标记案例分享
替尔泊肽（Tirzepatide）的分子量为4814 Da，研究者在替尔泊肽的侧链上引入4个14C放射性标记的碳原子[6]（图1），使其放射性比活度达到208 mCi/mmol（43 µCi/mg），满足后续ADME实验研究（SD大鼠：3 mg/133 µCi/kg，食蟹猴：0.5 mg/20 µCi/kg，人：4.1 mg/100 µCi/人）的需求。
图1. 14C标记的替尔泊肽
替尔泊肽附有C20脂肪酸二酸部分。脂肪二酸部分（二十烷二酸）通过谷氨酸和两个（2-（2-氨基乙氧基）乙氧基）乙酸单元（AEEA），连接到赖氨酸残基的侧链。[14C]-替尔泊肽的标记可以从替尔泊肽树脂中间体出发，应用固相多肽合成（SPPS）技术依次将双标记的[14C]AEEAc（注：连接两次）、Fmoc-Glu-OtBu（芴甲氧羰基-L-谷氨酸1-叔丁酯）和C20 DA-OtBu（二十烷二酸单叔丁酯）与多肽主链连接，最后将肽链从树脂上切割下来进行分离纯化得到[14C]-替尔泊肽。
根据2023年工业界发布的多肽药物ADME研究行业白皮书[9]，多肽药物若含有新型非天然氨基酸和/或被嵌入任何尚未上市药物的新的有机连接基团，一般建议对新的基团进行放射性标记，以开展多肽药物的ADME研究，从而表征其代谢和消除途径。
GLP-1多肽药物根据其结构特征可分为线性肽和环肽两类。
GLP-1线性肽药物的放射性标记：可以将14C引入到脂肪酸修饰侧链中，如2-(2-氨基乙氧基)乙酸或末端的C20脂肪酸上，能够标记4个或更多14C原子，使放射性比活度达到200 mCi/mmol。
GLP-1环肽药物的放射性标记：可以将14C引入到修饰的小环肽片段中，例如通过全标记的甘氨酸对环肽进行2个或4个14C原子的引入，获得足够的放射性比活度。
药明康德DMPK成功开发了多种14C标记的小分子砌块，包括用于氨基酸和GLP-1多肽药物脂肪酸修饰侧链的关键化合物，例如14C标记的C20脂肪酸和14C标记的2-(2-氨基乙氧基)乙酸等。
GLP-1多肽药物的放射性ADME研究考量
截至2024年底，FDA和EMA共批准9款GLP-1多肽药物（附表A），NMPA批准2款GLP-1多肽药物（聚乙二醇洛塞那肽和贝那鲁肽）[1]。通过总结FDA和EMA批准的9款GLP-1多肽药物的ADME研究内容，将GLP-1多肽药物在ADME中的研究考量归类如下。
物质平衡
除2005年第一个上市的GLP-1药物艾塞那肽，以及融合蛋白类药物杜拉鲁肽和阿必鲁肽之外，目前在FDA和EMA批准的GLP-1类药物，均使用放射性同位素进行了物质平衡研究。
大鼠与人的GLP-1受体（GLP-1R）同源性为90%，猴与人的GLP-1受体同源性更为接近，高达99%[10]，因此在已上市的GLP-1类药物的物质平衡研究中（如利拉鲁肽、司美格鲁肽和替尔泊肽），同时使用大鼠和猴进行临床前动物种属的物质平衡研究，并同步开展了人体物质平衡研究[6-8]。与艾塞那肽的结构相比，利西拉肽的结构中仅在羧基端缺失1个脯氨酸，并增加了6个赖氨酸（见附表A），以此增强了利西拉肽在体内的稳定性。二者的肽链结构都由天然氨基酸组成，未开展全面的放射性ADME研究。利西拉肽仅使用哺乳期雌鼠进行了乳汁排泄研究[11]。
根据文献中大鼠和猴的临床前数据[6,7]，肾脏排泄是经脂肪酸修饰的GLP-1多肽药物的主要排泄途径（占40% ~80%的给药剂量），粪便排泄占10~50%。但值得注意的是，结构修饰策略（如脂肪酸侧链修饰）可以改变排泄途径。
研究者开展了[14C]-替尔泊肽[6,7]在大鼠、猴和人体内的放射性ADME研究，均获得90%以上的物质平衡回收率（见表1），结果显示，替尔泊肽在大鼠和猴尿液中的排泄比例与粪便相当，在人尿液中的排泄比例稍大于粪便。而利西那肽和艾塞那肽则主要是通过肾小球滤过而清除[11,12]。
表1. 单次皮下给药[14C]-替尔泊肽后的放射性排泄总结
GLP-1多肽药物 | [14C]-替尔泊肽 | ||
种属 | 人（%Dose） n = 6 | SD大鼠（%Dose） n = 4 | 食蟹猴（%Dose） n = 4 |
给药量 | ~4.1 mg/人 | 3 mg/kg | 0.5 mg/kg |
100 µCi/人 | 133 µCi/kg | 20 µCi/kg | |
采集时间 | 0-36 days | 0-14 days | 0-28 days |
性别 | 男性 | 雄性 | 雄性 |
尿 | 66.1±3.6 # | 45.0±2.3 | 49.4±4.6 |
粪 | 33.2±4.2 # | 47.1±0.8 | 35.0±2.5 |
其它* | NA | 19.6 ±2.9 | 12.8±3.4 |
总回收率 | 99.4 ± 4.0 # | 112.0 ± 2.0 | 97.2 ± 1.8 |
*: 包括动物尸体、呼气和笼具清洗液等；
#：使用外推法得到的数据。
长效型GLP-1药物的清除半衰期时间长，例如司美格鲁肽在人体内的清除半衰期约为1周，因此物质平衡实验需要有更长的收集时间，以便调整样品的收集间隔（如从24 h调整为48~72 h），并且根据测定结果，及时调整样品收集方案。
分布
目前许多上市GLP-1药物以及在研的GLP-1类药物多选择采用定量全身放射性自显影技术（QWBA），进行临床前动物体内的组织分布研究[6-8]。应用QWBA研究总放射性在全身的分布情况，可以得到完整详细的组织分布结果，并可以根据各组织中的暴露量和消除半衰期，评估人体可接受的放射性安全剂量。关于QWBA的详细介绍可见专题文章，定量全身放射性自显影技术（QWBA）使组织分布实现可视化。
例如在大鼠单次皮下注射14C标记GLP-1多肽药物后，使用QWBA研究其在给药后24 h的分布图谱（见图2）。从图谱中可以看出，肾脏分布浓度极高，肝脏和小肠内容物等次之，在肺和棕色脂肪等中可观察到中浓度的分布，在脑、胃内容物和骨髓等中观察到低浓度的分布。表明给药后24 h药物主要分布在肾脏、肝脏和小肠内容物中。
图2. 大鼠单次皮下注射14C标记GLP-1多肽药物后24 h的QWBA图谱
代谢
GLP-1多肽药物的代谢特性是其ADME研究中的重要一环，了解代谢特性对于评估药物的安全性和有效性至关重要。利拉鲁肽、司美格鲁肽和替尔泊肽使用放射性示踪技术进行了体外肝细胞与血浆的代谢研究，以及大鼠、猴和人的粪便、尿液、血浆的代谢产物鉴定研究[6-8]。
GLP-1多肽药物因结构修饰的不同，主要代谢途径也有所不同，例如经过脂肪酸修饰的司美格鲁肽和替尔泊肽，其主要代谢途径为多肽骨架的肽键水解和脂肪酸的β-氧化[6,7]，而未经脂肪酸修饰的GLP-1多肽药物，如利西那肽，其主要代谢途径为肽键水解[11]。
值得注意的是，经脂肪酸修饰的GLP-1多肽药物在不同基质间的代谢物谱可能会有较大差异。例如[14C]-替尔泊肽在大鼠、猴和人血浆中的主要成分为母药，次要成分则是多肽骨架水解的代谢物，其脂肪酸侧链仍保持完整。而在排泄基质（尿液和粪便）中，母药未被检测到，主要代谢物由多肽骨架水解和脂肪酸侧链的β-氧化得到[6]。而由于其脂肪酸侧链发生的β-氧化，导致排泄基质中代谢物分子的亲水性发生较大变化，在常规的液相色谱柱上保留较为困难，给代谢产物鉴定带来一定挑战。
PK
除了口服司美格鲁肽之外，目前已上市的GLP-1多肽药物的给药方式均为皮下注射，具有较长半衰期（约1周）的特征，且大小动物之间PK数据差异可能较大，例如单次皮下给药[14C]-替尔泊肽后，在食蟹猴中血浆的Cmax/Tmax/t1/2是SD大鼠血浆的0.3/3/4倍左右[6]。替尔泊肽与[14C]-替尔泊肽在血浆中的Tmax时间基本一致。值得注意的是，在大鼠血浆中，替尔泊肽的平均系统暴露量约占血浆总放射性暴露量的87%，在猴中则占84%，表明大鼠和猴血浆中主要成分为母药。
表2. 单次皮下给药替尔泊肽或[14C]-替尔泊肽后的PK参数总结
PK参数 | SD大鼠 | 食蟹猴 | ||||
[14C]全血 | [14C]血浆 | TZP血浆 | [14C]全血 | [14C]血浆 | TZP血浆 | |
Cmax (ng eq/g or ng/mL) | 8340 | 16,300 | 19,600 | 2830 | 5160 | 6410 |
Tmax (hours) | 6 | 6 | 6 | 5 | 18 | 15 |
t1/2 (hours) | 57.2 | 25.6 | 9.03 | 101 | 103 | 56.3 |
AUC0-inf (ng eq⋅hour/g or ng⋅hour/mL) | 285,000 | 551,000 | 478,000 | 381,000 | 654,000 | 549,000 |
[14C] = [14C]-替尔泊肽; TZP = 替尔泊肽.
附表A. FDA和EMA批准的GLP-1多肽药物的汇总表
编号 | 商品名 | 活性成分 | 研发公司 /首次上市时间 | 分子量(Da) | 多肽结构 |
1 | Byetta | Exenatide (艾塞那肽) | AstraZeneca /2005年 | 4187 | H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-SerNH2 |
2 | Victoza | Liraglutide （利拉鲁肽） | Novo Nordisk /2010年 | 3751 |
|
3 | Lyxumia | Lixisenatide （利西拉肽） | Sanofi, Zealand /2013年 | 4859 | H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2 |
4 | Trulicity | Dulaglutide (杜拉鲁肽) | Eli Lilly and Company /2014年 | ~ 63000 | H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Gly-OH |
5 | Tanzeum | Albiglutide (阿必鲁肽) | GlaxoSmithKline LLC/2014年 | ~73000 | H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2 |
6 | Ozempic | Semaglutide (司美格鲁肽) | Novo Nordisk Inc /2017年 | 4114 |
|
7 | Mounjaro | Tirzepatide （替尔泊肽） | Eli Lilly and Company /2022年 | 4814 |  |
8 | Rybelsus | Oral Semaglutide (口服司美格鲁肽) | Novo Nordisk /2019年 | 4114 | NA |
9 | Bydureon | Exenatide long-acting release （艾塞那肽缓释剂） | AstraZeneca /2012年 | 4187 | NA |
结语
放射性同位素标记为GLP-1多肽药物的ADME研究提供了有力工具。未来GLP-1多肽药物的研究可能会集中在口服剂型的开发和新型给药系统的探索上，以进一步提高患者的依从性和治疗效果。药明康德DMPK拥有超十年的放射性项目研究经验及数百次放射性受试物的NMPA和FDA申报经验，具备完善的放射性标记物合成、物质平衡、组织分布、代谢物谱和代谢产物鉴定等技术平台，赋能客户顺利完成多次项目申报，助力全球客户快速推进药物研发流程。
作者：丁亚，熊冬冬，吴江林，郭莲，张玲玲
编辑：富罗娜·克里木，钱卉娟
设计：倪德伟，张莹莹
药明康德DMPK依托中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1700个新药临床研究申请（IND）。
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参考
[1] Gong B, Yao Z, Zhou C, et al. Glucagon-like peptide-1 analogs: Miracle drugs are blooming?[J]. European Journal of Medicinal Chemistry, 2024: 116342.
[2] 重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂药学研究与评价技术指导原则（征求意见稿），2024-12-16发布。
[3] Knudsen LB, Lau J. The Discovery and Development of Liraglutide and Semaglutide. Front Endocrinol (Lausanne). 2019; 10:155. Published 2019 Apr 12. doi:10.3389/fendo.2019.00155.
[4] Davide Audisio, Victor Babin, Frédéric Taran. Late-Stage Carbon-14 Labeling and isotope exchange: emerging opportunities and future challenges. JACS Au, 2022, 2: 1234-1251.
[5] Elmore CS. The use of isotopically labeled compounds in drug discovery [J]. Annu Rep Med Chem, 2009, 44: 515-534.
[6] Martin, J. A.; Czeskis, B.; Urva, S., et al. Absorption, distribution, metabolism, and excretion of tirzepatide in humans, rats, and monkeys[J]. Eur J Pharm Sci. 2024, 202: 106895.
[7] Jensen, L., Helleberg, H., Roffel, A., van Lier, J.J., Bjørnsdottir, I., Pedersen, P.J., et al.,2017. Absorption, metabolism and excretion of the GLP-1 analogue semaglutide in humans and nonclinical species. Eur. J. Pharm. Sci. 104, 31–41.
[8] US Food and Drug Administration. Pharmacology Review(s) (PDF) http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2010/022341s000pharmr_P1.pdf (2008).
[9] He M M, Zhu S X, Cannon J R, et al. Metabolism and excretion of therapeutic peptides: current industry practices, perspectives, and recommendations[J]. Drug Metabolism and Disposition, 2023, 51(11): 1436-1450.
[10] European Medicines Agency. Assessment report. http://www.ema.europa.eu/en/medicines/human/EPAR/ozempic (2017).
[11] US Food and Drug Administration. Pharmacology Review(s) (PDF) http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2016/208471Orig1s000PharmR.pdf (2016).
[12] US Food and Drug Administration. BYETTA™(exenatide) Label. http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2005/021773lbl.pdf (2005).
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