PROTAC药物的代谢产物鉴定研究策略

近年来，蛋白水解靶向嵌合体（Proteolysis-Targeting Chimera，PROTAC，在上下文中简称为“PROTAC”）因其相比于传统小分子药物更广的作用范围与更高的活性，而成为了生物医药领域的新一代“重磅疗法”。截至2022年8月，总计报道PROTAC分子超过3270个^[1]。据不完全统计，截至2023年3月，全球已经有约23个PROTAC药物进入到临床研究阶段^[2]（表1）。代谢产物研究在PROTAC药物研发的各阶段都发挥着重要的作用。本文将针对代谢产物鉴定研究在PROTAC研发各阶段的作用、研究过程中的挑战及策略进行介绍，为PROTAC的新药开发提供参考。

表1. 全球临床研究阶段的部分PROTAC药物信息一览（截至2023年3月）^[2]

备注：*表示获得FDA批准；#表示获得NMPA批准

代谢产物鉴定研究在PROTAC研发进程中的重要性

在PROTAC开发的初期，由于PROTAC分子量较大，为提升其渗透性与溶解度，药物设计往往需要在结构中引入杂原子，但这同时也增加了引入代谢软点的风险。另外PROTAC的linker部分在代谢时可能发生脱烷基或水解反应，得到linker断裂型产物^[3]。这些产物可能会与PROTAC的靶点竞争结合，从而抑制PROTAC发挥药效，或产生毒性反应，比如，linker断裂得到的E3连接酶配体片段可以作为分子胶与非目标蛋白结合，产生脱靶效应^[4]。通过体外代谢产物鉴定研究，可以帮助识别PROTAC的代谢软点和筛查linker断裂产物，以指导PROTAC的结构优化得到更具代谢稳定性的化合物。另外，由于PROTAC的代谢特征无法通过各组成部分的代谢特征来预测，因此必须把PROTAC整个分子作为新的化学实体来研究鉴定其代谢产物^[3]。

在临床前开发阶段，通过进行不同种属的体外代谢产物鉴定研究，可以评估PROTAC在不同物种之间的代谢差异，为选择适用于毒理研究的物种提供依据。同时，通过与体内代谢产物研究结果进行比较分析，可以评估PROTAC的体内外代谢相关性，进而推测在人体中的PROTAC代谢情况。另外，由于PROTAC存在脱靶风险^[5]，通过比较PROTAC及其产物在血浆和肝、肾、肿瘤等组织中的含量，可以帮助评估PROTAC的体内药效与毒性。在一期临床阶段，代谢产物研究可以帮助分析PROTAC在人体中代谢和清除的途径，并可用于评估临床前研究的毒理种属的选择是否合适。（图1）

图1. 代谢产物鉴定研究在PROTAC药物研发各阶段的作用

因此，有必要尽早开展PROTAC的代谢产物鉴定研究以助力其药物发现和安全性研究。而对于PROTAC的代谢产物鉴定实验方法与分析技术，相较于传统小分子药物有着更高的要求。这是由于PROTAC虽然属于小分子化合物范畴，但因其较大的分子量以及复杂的结构特征，代谢特征与传统小分子药物相比也存在显著的差异。

PROTAC代谢产物研究的挑战及策略

PROTAC分子的代谢产物鉴定流程与传统小分子药物类似（图2）。首先是选择合适的代谢研究体系进行体外孵育或动物体内给药，再将孵育得到的样品或采集的体内样品经蛋白沉淀、离心、移取上清液，或再经氮吹浓缩以及复溶等操作后进行LC-UV-HRMS分析。通过色谱将产物进行分离，再根据高分辨质谱的MS和MS²信号与原药信息进行对比，分析PROTAC的代谢途径和反应位点。

图2. PROTAC的代谢产物鉴定研究流程

然而，由于PROTAC药物有着与常规小分子不同的结构特征和代谢特征，因此，其代谢产物研究存在着更多挑战，包括体内外模型如何选择，样品前处理过程中母药的非特异性吸附与溶解度问题如何解决，数据分析环节如何快速获得代谢产物的相对丰度并高效精准地完成结构表征。

基于药明康德代谢产物鉴定团队丰富的研究经验，我们在进行PROTAC代谢产物鉴定研究时制定了合理的研究策略以应对这些挑战（图3），从而为客户提供高质量的研究报告，以加速PROTAC分子的药物研发。下文将对这些策略进行具体的介绍。

图3. PROTAC代谢产物鉴定研究的挑战及解决策略图

01 代谢模型的选择

选择合适的代谢模型是顺利开展体外代谢产物研究的前提与基础。对于PROTAC分子的研究，应该从哪些维度来选择合适的代谢模型呢？

根据实验目的以及具体分子的结构特征，可以采用不同的体外代谢体系进行实验（表2）。当需要研究PROTAC在血中水解酶作用下的代谢稳定性情况时，可选择体外血浆或全血孵育；当涉及醛氧化酶参与代谢时，需要选择肝S9或肝胞浆作为代谢体系，特别是对于含有VHL配体的PROTAC，其噻唑环可能在醛氧化酶的催化下发生羟化^[3]；当研究CYP酶及非I相代谢酶对化合物的影响时，可以选择肝细胞体系。另外，对于较大分子量的PROTAC分子，由于其细胞渗透性较差，在研究仅CYP酶参与的反应时，肝微粒体体系相比肝细胞体系更为合适^[6]。当需要评价PROTAC在动物体内外代谢的相关性并预测人体内的代谢时，可以选用动物血浆、全血、尿液、粪便、胆汁等体内样品进行代谢产物研究。人体内样品的代谢产物鉴定研究可以评价PROTAC在人体内的暴露情况，以及毒理种属的选择是否合适。

表2. PROTAC的体内外代谢研究体系和目的

02 方法开发

在PROTAC分子的方法开发环节中，样品的非特异性吸附和溶解性问题是常见挑战。处理不当可能严重影响代谢产物分析结果的全面性和准确性。因此，有必要提前方法开发并建立完善的策略以应对这些挑战。

针对非特异性吸附问题，由于PROTAC分子量较大且容易与耗材表面发生非特异性结合^[7]，建议使用低吸附耗材，并在方法开发阶段对化合物进行吸附性考察。如果发现化合物与耗材发生非特异性结合，需要添加适量的解吸附剂，可参考相关文章：PROTAC药物在生物样品分析中的挑战。

对于溶解性问题，首先通过考察PROTAC的回收率来判断其溶解性，并选择合适的溶剂。当回收率不足时，会导致遗漏代谢产物、半定量结果不准确等，从而使得代谢产物鉴定结果不可靠。例如，某PROTAC分子在乙腈/水混合溶剂中，肝细胞孵育0分钟的样品回收率较低且体系出现分层现象。调整乙腈比例后仍未改善，因此选择在复溶液中加入其他有机试剂。实验发现，当复溶液为多种有机试剂与水形成的混合溶剂时，回收率最高，满足分析要求（图4）。解决PROTAC溶解性问题的策略主要包括在化合物溶解、稀释及前处理的某些环节使用含有混合有机试剂的溶液，或者直接使用经蛋白沉淀并离心后的上清液进行LC-UV-HRMS分析等。

通过采用这些策略，可以有效克服PROTAC样品的非特异性吸附和溶解性问题，确保代谢产物分析与鉴定结果的全面性和准确性。

图4. 某PROTAC在不同复溶液中的LC-UV谱图

03 代谢产物的结构表征

结构表征是代谢产物鉴定中至关重要的环节。对于PROTAC分子而言，由于其较大的分子量和含有多个反应位点的特点，高效高质量地完成结构表征成为代谢产物研究中最大的挑战之一。为应对这些挑战，我们通过大量实验探索和经验积累，建立了一套专门针对PROTAC代谢产物筛选和结构鉴定的策略（图5），结合了代谢产物专业鉴定软件Mass-MetaSite、资深的科学家和高分辨质谱平台的优势。

图5. PROTAC结构表征流程

在这一策略中，我们依靠经验丰富的专业人员，通过对LC-UV-HRMS分析数据中的紫外和质谱信息进行解析，对代谢产物的结构进行表征。这包括通过色谱峰的寻找和质谱碎片信息的解析，从而实现对PROTAC代谢产物的代谢途径和代谢位点的解析。同时，我们还利用Mass-MetaSite软件进行代谢物的自动化筛选和鉴定，计算出代谢途径和可能的代谢位点，并将其与实验结果进行结构匹配。这样的整合利用有助于加速研发人员对PROTAC代谢物结构的表征过程。

另外，药明康德DMPK的研发平台拥有业界领先的Thermo Scientific™ Orbitrap Eclipse™ Tribrid™质谱仪，可获得多级（3级及以上）质谱数据。在结构表征的过程中，研发人员会使用多级质谱数据，对候选药物及其代谢产物的质谱裂解行为进行深度分析，得到更精细的碎片信息，实现精准定位，从而高质量地完成结构表征。

通过我们的策略，结合专业软件、经验丰富的专家团队和业界领先的高分辨质谱平台，我们能够在代谢产物鉴定中高效地进行结构表征，解决PROTAC分子复杂性带来的挑战，加速PROTAC代谢产物研究的进程，为PROTAC药物的设计和开发提供重要支持。

04 代谢物半定量

通过对表征的代谢物进行半定量分析，可以估算母药及其各代谢产物的相对丰度，初步获得各代谢产物的大致比例，发现主要代谢产物，这对于识别代谢软点、比较不同种属间的体外代谢差异、以及比较体内外代谢差异是非常必要的，为后续药物进一步结构优化、推测人体中药物代谢情况、以及代谢产物安全性评价提供依据。

鉴于PROTAC的结构特征，有必要考虑如何使半定量的结果更加准确^[8]。当使用MS进行半定量时，母药及其产物在离子源中离子化效率的差异会影响质谱半定量数据的准确性。此外，PROTAC及其产物除了产生单电荷离子外，往往会产生多电荷离子以及源内裂解的离子（图6A），在通过质谱积分进行半定量的过程中需要充分考虑这些因素，将单电荷离子、多电荷离子以及源内裂解的离子同步提取积分，增加半定量的准确性。例如，我们在某PROTAC项目的研究过程中针对某代谢物进行提取离子流积分，其单电荷及多电荷离子的提取离子流叠加后的峰面积约为单电荷提取离子流峰面积的8倍（图6B）。

当使用UV谱进行半定量时需要注意，当PROTAC的E3连接酶配体与POI配体具有不同的紫外发色团时，linker断裂的产物可能在吸光系数方面与母药不同，从而显著降低UV半定量数据的准确性（图6C），此时可以考虑其他检测器，如CAD等。

因此，代谢产物半定量的方式往往需要结合其结构特征、UV谱及质谱等行为进行综合考虑。

图6. PROTAC及其代谢产物紫外与质谱的表征图

（A）某PROTAC及其代谢产物在质谱中显示出双电荷离子、加合离子及源内裂解峰^[8]；

（B）某PROTAC代谢产物的提取离子流；

（C）某PROTAC及其代谢产物的紫外积分图^[8]。

结语

药物代谢产物的结构鉴定是药物代谢研究的核心与难点，PROTAC分子因其结构的复杂性使得其代谢产物鉴定的工作面临较大的挑战。凭借药明康德DMPK部门上万个PROTAC分子的体内外筛选评价经验，依托先进的Waters ACQUITY UPLC液相系统与Orbitrap Eclipse™ Tribrid™和Q-Exactive™ HF等质谱系统，结合Mass-MetaSite、Compound Discoverer和Metabolynx等数据处理软件，药明康德DMPK代谢产物鉴定团队开发了基于超高效液相-高分辨质谱（UPLC-UV-HRMS）技术的PROTAC代谢产物分析与鉴定的研究平台（图7），并针对实验进程中的难点制定了一系列完善的对策，助力客户快速推进PROTAC新药研发项目。

图7. PROTAC代谢产物鉴定研究LC-MS平台

作者：王骏杰，张洪，李瑞兴，曹卫群

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹

药明康德DMPK依托中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1700个新药临床研究申请（IND）。

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