基于自研PeptideMID软件的多肽代谢产物鉴定平台构建与应用

多肽类药物因其独特的分子特性，在传统小分子药物或生物大分子药物难以调控的“不可成药靶点”（undruggable targets）方面展现出显著优势，例如蛋白质-蛋白质相互作用等“不可药物化”的靶点。自1921年胰岛素首次实现临床转化以来，多肽药物已历经百年发展历程，取得显著成就，目前全球监管机构累计批准的多肽药物已超过80种。值得关注的是，近年来随着度拉糖肽、司美格鲁肽等创新药物的成功上市，多肽药物的研发热潮持续升温。本文将阐述多肽药物代谢产物鉴定及数据解析中的挑战，并通过案例分享介绍PeptideMID软件平台如何提升该研究的准确度与效率。

多肽药物的结构特征及代谢产物鉴定研究

多肽药物的研究始于对内源性生物活性物质的基础研究。早期研究聚焦于胰岛素、催产素、加压素及促性腺激素释放激素等天然人类激素的药理特性解析。随着21世纪结构生物学解析技术、重组生物技术以及新型合成和分析平台的突破性发展，多肽药物的发展得到进一步显著加速，建立了涵盖多肽药物发现、药物设计、多肽合成、结构修饰和活性评估在内的复杂及完整的研究开发系统。然而，多肽药物固有的化学与生理稳定性较差，易被蛋白水解酶降解，导致其存在口服生物利用度低、代谢清除速率快和体内半衰期短等药代动力学挑战。研究表明，通过引入环化结构、端基化学修饰、氨基酸残基替换等药物化学修饰策略，可以显著提高多肽的稳定性^[1,2]。

在药物研发过程中，DMPK研究对表征多肽类药物的安全性和有效性具有关键作用。其中，代谢产物鉴定（Metabolite Identification，MetID）作为非常重要的研究环节，为阐明药物代谢途径和评估代谢产物提供了重要依据。具体可以参考《多肽药物的研发和药代动力学研究策略》和《37款已上市多肽药物ADME研究总结及放射性研究考量》。

多肽药物的MetID及数据解析挑战

多肽药物在治疗多种疾病中发挥重要作用，但其化学与生理稳定性较差，易被降解，导致口服生物利用度低、代谢快和半衰期短等问题，因此需要进行化学修饰以改善成药性。然而，当多肽结构中引入非天然氨基酸和/或有机连接基团时，会产生新的代谢位点，需进行代谢产物鉴定研究以识别代谢软点，持续优化分子结构，并支持新药申报^[1,2]，如之前文章《多肽药物代谢产物鉴定研究的挑战和策略》介绍，多肽药物的代谢产物鉴定具有如下挑战：

1. 代谢途径复杂：多肽分子内存在多个潜在酶切位点，代谢物数量庞大，如果涉及（多）环化，理论代谢产物数量更是会呈指数级增长。

2. 检测难度大：通常多肽药物及其代谢产物在体内浓度较低，紫外吸收较弱，传统检测方法难以满足需求，往往依赖于质谱数据的处理和挖掘。

3. 质谱数据解析复杂：多肽在质谱分析中形成多电荷离子，在串联质谱数据中易发生脱水、脱氨等副反应，碎片数据复杂，增加碎片离子归属难度。

目前在多肽的MetID研究中，数据处理仍然是限速步骤。现有技术路径主要依赖于背景扣除、人工解析和有限的商业化软件辅助。现有的主流商业化软件在支持多肽MetID方面存在局限性：

1. 基于结构预测代谢物的软件在处理环肽或非天然氨基酸修饰的多肽时，识别能力有限，对于多肽的多电荷识别准确性不足，有大量假阳性结果；

2. 适用于小分子药物的代谢分析软件在大分子或非标准氨基酸修饰的多肽中，数据解析的准确性受限；

3. 主要用于蛋白和抗体类药物的软件在多肽代谢物鉴定方面缺乏针对性，主要支持线性肽和含有二硫键的环肽，对于复杂多肽结构适用性不强。

自研软件PeptideMID的创新应用与案例展示

针对复杂多肽结构代谢产物鉴定的技术挑战，为了弥补商业化软件的不足，药明康德DMPK开发了多肽药物代谢产物鉴定的解析平台PeptideMID，该平台包含PeptideID和PeptideMS2两个模块。

PeptideID模块

基于多肽的氨基酸序列和结构修饰，能够自动预测其代谢产物并构建质谱数据库，且支持包括线肽、环肽、多环肽及钉合肽等不同骨架类型，同时还支持非天然氨基酸和有机基团的自定义输入。通过与高分辨质谱数据的自动匹配，可快速识别潜在代谢产物。其核心算法能够针对复杂结构进行优化匹配，克服了传统软件的局限性。

PeptideMS2模块

专门用于解析多肽的二级质谱数据，能够自动识别关键碎片离子，提高代谢产物鉴定的准确性。尤其适用于非标准化结构的多肽，实现高通量数据处理。

通过以下的实际案例可进一步展示自研软件的适用性和应用效果。

案例一 三种上市多肽药物的体外肾S9 MetID研究

三种上市多肽药物亮丙瑞林（Leuprorelin）、西曲瑞克（Cetrorelix）和去氨加压素（Desmopressin）在肾S9中孵育90分钟后，采用LC-HRMS进样分析。图1展示了PeptideMID鉴定的代谢物和文献中代谢物的对比情况^[3]，结果表明PeptideMID平台有效识别和解析代谢物，相比文献中的CD软件结合人工的数据处理方式，PeptideMID平台在效率和质量上具有明显优势。

图1. 三种上市多肽体外肾S9代谢产物PeptideMID和文献报道的鉴定结果对比图

案例二 Peptide-1体外血浆代谢产物鉴定研究

Peptide-1在体外血浆中孵育后，采用LC-HRMS检测。如图2所示，PeptideMID成功检测到M1-M4四个代谢物，其中M1、M2和M4是同分异构体，均来源于Peptide-1的一个肽键水解，M4的相关丰度超过30%。通过质谱碎片解析，精准定位了M4的水解位点位于第八和第九个氨基酸之间的肽键。结果表明，PeptideMID能够有效识别和鉴定多肽代谢产物。这些高质量的MetID研究结果对于多肽的结构优化和药物开发提供了重要的科学依据和强有力的数据支持。

图2. Peptide-1体外血浆代谢产物研究结果和M4碎片解析图

结 语

多肽药物在治疗抗肿瘤、免疫调节及代谢性疾病等治疗领域中发挥重要作用，然而，其固有理化性质不稳定性（如易受蛋白水解酶降解）引发了一系列的药代动力学问题，包括口服生物利用度低、血浆半衰期短等关键问题，影响其临床转化。通过药物化学修饰如环化、端基修饰和氨基酸替换等药物化学优化手段，可显著提升多肽分子稳定性。但伴随多肽结构复杂性的增加，使得代谢产物鉴定充满诸多挑战。

代谢产物鉴定研究在药物开发全周期中具有重要意义：在非临床阶段识别代谢软点（Metabolic soft spots）、指导先导化合物优化及支持临床申报；临床阶段主要关注人体特有的代谢物或者高比例代谢物（>10%母药相关暴露量），为代谢产物的安全性研究提供指导。现有商业化代谢产物鉴定软件在处理复杂多肽结构时，存在技术局限性，其核心缺陷源于算法架构的适配性问题，难以准确识别和解析所有代谢产物。

药明康德DMPK通过技术攻关，自主研发并构建了PeptideID和PeptideMS2等代谢产物解析软件，并应用到实际项目中，提升了MetID研究的解谱效率和准确性。通过自动化的数据处理，克服了传统软件的不足，并为未来技术的应用奠定了基础。展望未来，随着相关技术的不断进步，MetID研究将迎来新的突破。这些技术有望进一步提高数据处理速度和准确性，优化代谢产物预测模型，并提供更深入的代谢机制洞察。新的技术和方法的结合将推动多肽药物研发进入新的高度，为药物的安全评估、结构优化和个性化治疗提供坚实的数据支持。

作者：李鹏，曹卫群

编辑：富罗娜·克里木，钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹

药明康德DMPK依托中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1700个新药临床研究申请（IND）。

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