放射性同位素标记化合物合成策略及其应用

放射性标记在药物开发和研究中发挥着关键作用。通过放射性标记，研究人员将药物分子中的原子取代为相同原子的同位素，比如使用同位素碳-14取代碳-12原子，通过放射性示踪技术可以很容易地追踪到研究药物在体内的吸收、分布、代谢和消除行为（图1）^[1]，且不会干扰化合物的正常药代动力学特征，具有灵敏度高、特异性强、检测简便、应用广泛等优点。最常见的药物分子（化学合成）的放射性标记同位素为碳-14和氢-3(氚)。

图1. 放射性同位素碳-14化合物示踪技术的应用

碳和氢存在于大多数药物分子中，碳-14和氢-3的半衰期分别约为5730年和12.35年，长半衰期决定了碳-14和氢-3实验所测得的数据不需要进行物理半衰期校正。因为碳-14的储存稳定性好于氢-3，因此会优先选择碳-14作为放射性标记同位素。针对放射性标记化合物的药代动力学研究，我们已整理发布专题文章：

1. 如何用全身放射性自显影技术研究抗体偶联药物（ADC）在荷瘤小鼠的组织分布

2. 定量全身放射性自显影技术（QWBA）使组织分布实现可视化

3. 解读FDA指导原则，如何通过设计临床1期和临床前实验为人体放射性试验做准备

4. 放射性核素标记技术在抗体偶联药物（ADC）药代动力学研究中的应用

5. 37款已上市多肽药物ADME研究总结及放射性研究考量

本文将主要围绕碳-14标记合成的特点和策略进行阐述，并且分享药代动力学研究过程中放射性同位素标记合成的关键考量。

碳-14标记合成简介及特点

碳-14的原子核由6个质子和8个中子构成，在发生β衰变释放低能量β射线的同时，一个碳-14原子转变为一个氮-14原子，平均辐射能量为 56 keV，在空气中最大的穿透距离约为20厘米，在玻璃介质中的穿透距离仅仅约为170微米^[2]。通常以放射性活度来描述处于某一特定能态的放射性核素在单位时间内的衰变数。放射性活度的国际单位是贝可 （Bq），常用单位是居里（Ci）、毫居里（mCi）等。放射性比活度（specific activity）是指放射性物质的放射性活度与其质量之比，国际单位为贝可/摩尔(Bq/mol)， 常用单位是兆贝可/毫摩尔（MBq/mmol）, 毫居里/毫摩尔（mCi/mmol）等。一个碳-14完全标记的化合物放射性比活度为62.4 mCi/mmol。由于环境中碳-12的普遍存在，碳-14 标记原料中碳-14的纯度一般为80-90%， 即放射性比活度在50~60 mCi/mmol之间，合成获得的碳-14终产物的放射性比活度稍低，通常在40~50 mCi/mmol之间。

自20世纪40年代出现了核反应堆起，工业界就开始了碳-14化合物的标记和应用。对于化合物能否进行碳-14标记，可从以下方面考量：

1. 化合物是否可以化学合成；

2. 终产物的放射性比活度和放化纯度的要求，如需高比活度的放射性标记化合物，可考虑多碳-14标记或者氢-3标记；

3. 合成过程中的化合物稳定性及安全性等。

碳-14标记化合物合成的策略

碳-14化合物标记位点的选择，应从以下几点考量：

1. 确保标记位点在主要的结构片段中；

2. 标记位点应远离化学结构不稳定的位点或代谢位点；

3. 应尽量选择合成步数短的位点，避免合成成本过高，且得率过低导致放射性废弃物过量；

4. 标记合成路线适用于放射性辐射安全管理等。

药明康德药性评价部标记合成团队积累了丰富的经验，经过多年的研究开发与探索，已储备200余种碳-14衍生中间体的合成方法，并成功应用到碳-14化合物的标记合成中以提高成功率和得率。常用的衍生中间体介绍及标记合成策略如下：

碳-14碳酸钡衍生的中间体

碳-14碳酸钡（Ba¹⁴CO₃）是放射性有机合成中的第一个碳-14原料，由它为起始原料可转化为四种常用的同位素原料， 即碳-14二氧化碳、碳-14氰化钾，碳-14乙炔和碳-14钡氰胺(BaN¹⁴CN) ^[2]。这四种衍生的同位素原料可进一步合成各种复杂的中间体（图2） 。

图2. 碳-14碳酸钡为原料合成衍生的中间体

固体原料碳-14碳酸钡可以看成是碳-14二氧化碳气体的储存形式，其通过与浓硫酸反应生成碳-14-二氧化碳气体，进一步应用有机化学合成技术可以转化为更多的碳-14标记中间体，如碳-14羧酸、碳-14甲醇、碳-14甲醛等，再由这些中间体原料转化为更多的中间体或最终化合物，例如：碳-14碘甲烷、碳-14乙腈、碳-14卤素乙酸（酯）、碳-14氰基乙酸（酯）、碳-14-β-酮酸（酯）、碳-14丙二酸（酯）和碳-14尿素等（图3）。这些衍生的标记中间体，可满足大部分小分子化合物的需求，助力快速推进药物研发流程。

图3. 以碳-14碳酸钡为原料衍生的碳-14标记中间体

碳-14氰化钾衍生的中间体

以碳-14氰化钾为起始原料，可合成碳-14标记的氰化锌、氰化亚铜、氰基溴化物、甲酸、硫氰酸盐、氰基烷烃和芳烃等中间体，再由这些中间体通过多步化学反应得到终产物。据文献报道，化合物BI665915是一种新型选择性5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)抑制剂，从化合物BI665915的结构特点和放射性标记位点的合成难易程度看，标记1,2,4-噁二唑环是极佳选择，即需在化合物5（图4）吡唑的4号位标记羧酸。可从原料碳-14碳酸钡标记羧酸。但由于其转化率低且会产生大量的放射性废物，更优的选择是以碳-14氰化钾为起始原料，提高转化率，降低成本（图4）^[3]。

图4. 碳-14 BI665915的合成路线

*表示碳-14标记的位置

碳-14标记合成手性氨基酸和生物碱

药明康德药性评价部标记合成团队具备碳-14手性氨基酸和碳-14生物碱等标记中间体的合成能力，包括碳-14标记的甘氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、尿嘧啶、胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤等（图5）。这些常用的碳-14标记的手性氨基酸和生物碱及其衍生物是标记多肽（Peptide）和寡核苷酸（Oligo）等新分子实体化合物的关键中间体。

多肽化合物的标记挑战主要在于：

（1）各种手性氨基酸（天然和非天然）的标记合成以及氨基酸合成中的手性控制;

（2）多肽分子量较大，要达到药代检测所需要的放射性比活度，需要引入多个碳-14原子。

含有创新结构基团的多肽需要开展临床物质平衡研究（可参考：37款已上市多肽药物ADME研究总结及放射性研究考量），而氢-3存在氢氚交换并不适合临床研究，因此多肽化合物的放射性同位素标记推荐使用碳-14进行。我们通过多个碳-14标记中间体，应用固相多肽合成（SPPS）技术成功标记多个多肽化合物，并且比活度大于200mCi/mmol，适用于分子量大、给药剂量低的多肽化合物及多肽偶联药物的药代动力学研究。

图5. 部分碳-14标记的手性氨基酸和生物碱

碳-14标记XDC化合物

其中，ADC标记合成的挑战主要在于ADC分子包含抗体，其结构复杂，分子量大，给药剂量低，因此payload和/或linker上标记的放射性同位素需要足够高的放射性比活度，提高检测下限，以便样品总放射性的检出。综合来看，氢-3或者多个定点标记的碳-14是比较合适的选择。图6展示了我们结合ADC药物分子的特点和团队的标记合成经验，引入多个碳-14到payload分子上，进一步采用特定的连接子将抗体和碳-14标记的payload连接起来，以达到药代动力学的检测需求。

图6. 抗体偶联药物（ADC）的碳-14标记合成

*表示碳-14标记的位置

随着技术不断进步,生物偶联药的边界在不断拓展，通过对偶联药物靶点、抗体、有效载荷及连接子和偶联技术不断迭代创新，已涌现出多种新型XDC偶联药物。我们同时具备多肽偶联药物的合成能力。

药明康德药性评价部标记合成团队介绍

药明康德药性评价部（DMPK）标记合成实验室成立于2012年，已配备多种高标准实验室设备，拥有十余年放射性同位素合成经验，服务全球新药研发客户，已完成500余个放射性化合物的标记合成。

特点和优势

定制化方案

放射性标记合成，可以参照其常规工艺路线，并结合团队代谢稳定的判断经验来设计合适的标记位点。一般将碳-14/氢-3引入到化合物的药效基团和/或代谢更低风险的位点上，同时兼顾标记合成的成本和有效性，提供定制化的标记合成方案。

新分子策略

放射性化合物一体化平台，涵盖小分子化合物、PROTAC（蛋白降解靶向嵌合体，Proteolysis-Targeting Chimera)、 XDC（抗体偶联药物和多肽偶联药物）、Peptide（多肽）等新分子实体化合物的标记合成，并提供临床前和临床ADME整体研究策略。

全流程运输

拥有丰富的放射性化合物全球运输经验，物流体系能够全流程服务于客户，确保及时有效送达。

图7. 放射性标记化合物合成相关仪器平台

结语

稳定可靠的标记位点是放射性同位素示踪技术应用于药物研发的前提条件，药明康德药性评价部具有多年的代谢稳定性研究和放射性合成经验，为化合物的定制化合成保驾护航，确保延续的体内外ADME研究结果准确、可靠。药明康德药性评价部（DMPK）拥有放射性标记物合成、物质平衡、组织分布、代谢物谱和代谢产物鉴定等技术平台，且拥有超十年放射性项目研究经验及数百次放射性受试物的NMPA和FDA申报经验，助力全球客户快速推进药物研发流程。

作者：占红文，吴江林，张玲玲

编辑：钱卉娟，富罗娜·克里木

设计：倪德伟，张莹莹

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1500个新药临床研究申请（IND）。 

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