PROTAC成药性研究：溶解度和渗透性研究策略解析

蛋白降解靶向嵌合体即Proteolysis-Targeting Chimeras（在上下文中简称为“PROTAC”）由于其独特的作用机制逐渐发展成最为热门的小分子之一，获得众多资本青睐，成为新药研发的新风向。但是机遇与挑战并存，在它的成药性研究中出现了诸多具有挑战性的问题，其中讨论最多的一个问题是，PROTAC不同于传统的小分子药物，不满足经典的类药五原则（Rule of Five）。PROTAC被认为违反了药物化学的信条，是被重新定义的小分子化合物。也正是因此，PROTAC的口服吸收差是一个普遍的问题。为筛选获得具有一定口服生物利用度的PROTAC分子，需要表征或优化一系列的参数，包括溶解度、亲脂性、代谢稳定性、渗透性等。本文主要讨论PROTAC分子的溶解度与渗透性这两个与口服吸收非常相关的参数，希望为PROTAC分子的研发提供思路。

图1. PROTAC的作用机理^[1] 

一、PROTAC分子不符合类药五原则

PROTAC的结构整体上相当于三个小分子的组合：一侧分子区域结合E3连接酶，另一侧分子区域结合目标蛋白，中间区域为接头分子（Linker）。根据这一结构特征，PROTAC的分子量通常会比较大，一般会达到700以上。口服小分子药物如果想要获得较好的药代动力学性质、较高的生物利用度，一般需要满足类药五原则:

• 分子量小于500；

• 氢键供体数目小于5；

• 氢键受体数目小于10；

• 脂水分配系数小于5；

• 可旋转键的数量不超过10个；

而事实上，PROTAC分子很难满足类药性五原则，甚至与成药性好的分子大相径庭。Vasanthanathan等人^[2]比较了基于不同E3连接酶的PROTAC分子与Drugbank收录的口服药物的化学特性，发现它们完全处在不同的区域。此外，PROTAC的性质与E3连接酶的种类也具有密切的关系。文献报道应用到PROTAC的E3连接酶主要有CRBN、VHL、cIAP和MDM2，其中使用频次最高的主要是CRBN和VHL两种。下图中基于VHL的PROTAC（绿色）远离口服药物区域，文献报道此类PROTAC生物利用度确实较低。而基于CRBN E3的PROTAC（红色）更接近口服药物区域，进入临床II期的两个PROTAC分子ARV-110和ARV-471，也就是下图的分子1和2，都是CRBN E3连接酶的配体。这也许说明，越接近类药性五原则的PROTAC，越会有更好的药代动力学特性。

 图2. 比较PROTAC分子与DrugBank收录的口服药物的化学特性^[2]

蓝色代表DrugBank收录的口服药物（n=888），红色、绿色和灰色分别代表CRBN、VHL 和其他 E3连接酶的PROTAC（n=2082），A图中蓝框内为ARV-110和ARV-471

很早就有研究表明，药物的体外溶解度和渗透性与人体内药物吸收的程度具有非常紧密的关系。高溶解度、高渗透性的药物，往往具有较好的生物吸收程度^[3]。针对PROTAC分子，我们也在体外评价它们的溶解度和渗透性，希望找到一定的方法，帮助筛选得到生物吸收较好的PROTAC分子。

二、PROTAC的溶解度研究

常规溶解度研究会检测化合物在pH7.4的磷酸缓冲液中的溶解度，但是对于PROTAC分子而言，仅检测磷酸缓冲液中溶解度是不够的。已有文献报道，PROTAC分子在模拟的禁食肠液（FaSSIF）和模拟的不禁食肠液（FeSSIF）中溶解度大大提高，并且在模拟的不禁食肠液中溶解度最佳。我们也在研究中发现相似的趋势。

图3. PROTAC分子在不同缓冲溶液中的溶解度^[4]

药物的口服吸收发生在肠道，显然生理溶液中的溶解度更接近PROTAC肠道吸收的真实环境。也就是说，在磷酸缓冲液中溶解度差并不是绝对的，还需要关注PROTAC在生理溶液中溶解度。在模拟的不禁食肠液中溶解度最佳，提示PROTAC的体内药代动力学研究采用餐后给药的方式或许能得到更好的体内药物暴露量。Arvinas 公司公布的ARV-110和ARV-471的临床试验设计也披露了这两个PROTAC分子的I期临床给药方式均为“once daily with food”。此外，我们也在研究中发现，餐后给药可以提高一些PROTAC分子在动物体内的暴露量。

解决PROTAC化合物溶解度问题的另一个方法就是使用制剂手段来优化给药制剂。研究显示，使用无定形固体分散体（比如喷雾干燥、热熔挤出）、纳米递送系统、自乳化递送系统或在前期筛选使制剂澄清的溶媒有助于增加体内的暴露量。药明康德DMPK的制剂团队有着丰富的临床前制剂筛选经验，可根据化合物特性选择合适的溶媒提高化合物的暴露量。

三、PROTAC的渗透性研究

渗透性是另一个影响药物吸收的关键参数。常用的体外渗透研究的模型包括Caco2、MDCK、LLC-PK1、 PAMPA等。在PROTAC分子的研究中，PAMPA由于其非细胞结构的限制性并不被推荐为合适的体外渗透性模型。PROTAC体外渗透性研究可选用Caco2、MDR1-MDCK或LLC-PK1细胞。但是无论是在什么模型中， PROTAC分子都表现出了较低的渗透性（图4）。我们也在研究中发现大多PROTAC分子在Caco2细胞渗透性研究中显示为低渗化合物。此外，文献中的结果显示，分子量越高的PROTAC越有可能是外排转运体的底物。

图4. PROTAC的分子量与渗透性^[1]

a) PAMPA与细胞模型的相关性，虚线以内为低渗；

b) P-gp外排比与分子量关系；

c) 不同分子量化合物在LLC-PK1细胞模型中的渗透性，其中分子量小于650为单个配体，大于650的为完整PROTAC；

d) 不同分子量化合物在PAMPA模型中的渗透性，其中分子量小于650为单个配体，大于650的为完整PROTAC

除了渗透性低，在常规的细胞模型中得到的结果通常还伴随着回收率不足的特点，较低的水溶性加上对耗材较高的吸附性也导致了大多数PROTAC分子在体外渗透性研究中回收率不足。回收率较低，则无法判断渗透性数据是否准确，数据的可参考性也就大打折扣。为解决这个问题，药明康德DMPK进行了相关研究。采用添加BSA的转运缓冲液，或采用生理溶液作为转运缓冲液，可大大提高PROTAC分子在Caco2实验中回收率。目前改进的Caco2体系已经被推荐用于PROTAC的体外渗透性研究。

四、PROTAC分子构象的“变色龙”特性

PROTAC化合物普遍具有长条形的结构，具有较大的分子量和极性以及大量可旋转键。它到底是如何透过细胞膜的脂质双分子层的呢？Atilaw等人^[5]的研究也许能给我们一些提示。他们发现，PROTAC分子就像一条变色龙，它的构象会随环境发生变化。在模拟细胞外（DMSO）或细胞内的溶液中（DMSO与水10比1混合），PROTAC分子呈现长条形、分子极性较大。但是在模拟细胞膜的溶液中（氯仿），PROTAC会通过形成分子内的氢键、π−π 键等作用折叠起来，变成极性表面积较小的分子。也就是从一个极性分子的构象，转变成非极性分子的构象。这也提示我们，PROTAC的渗透性好坏，很可能与它在渗透过程中能否形成极性表面积较小的构象相关。

图 5. PROTAC在不同溶液中的构象变化

结语

对于常规小分子而言，体外渗透性与体内吸收往往具有良好的相关性。但是对于PROTAC分子而言，这种相关性并没有得到大量数据的支持。我们也在研究中发现，体外研究判断为低渗透的PROTAC分子在动物体内中也可能展现较好的口服生物利用度。此外，Atilaw等人提出PROTAC的“变色龙”特性也提示了该类分子渗透机理的复杂性。因此，建议谨慎应用体外渗透性的数据用于PROTAC的分子筛选。推荐体外研究结合体内药代数据，筛选口服吸收较好的PROTAC分子。在体内药代研究中，通过比较禁食和不禁食的差异，选择适合的给食方式。同时推荐采用澄清且在胃肠道没有析出风险的溶媒进行早期的筛选评价。我们也期待更多PROTAC数据的披露来帮助利用体外溶解度和渗透性研究结果预测体内生物吸收。

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作者：马利萍，李成园，金晶

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟