共价抑制剂药物研发中的DMPK考量

近年来，随着越来越多的共价抑制剂的成功上市，如EFGR、BTK、KRAS G12C抑制剂以及新冠口服药奈玛特韦的获批，共价抑制剂引领了小分子药物开发的热潮。本文从DMPK角度分享共价抑制剂研发过程中的一些考量。

一、共价抑制剂介绍

共价抑制剂指与酶或受体等生物大分子形成共价结合，通过共价键的形成使生物大分子失活的药物。阿司匹林（乙酰水杨酸）于1899年上市，是最早的共价抑制剂药物。1928年发现第二个共价抑制剂青霉素，其通过与细菌的转肽酶上的丝氨酸残基形成共价键抑制细菌繁殖（图1）^[1]。

图1. 早期的共价抑制剂药物。

a）阿司匹林的作用机制；b）青霉素的作用机制

早期的共价抑制剂的发现带有偶然因素，开发的时候并不清楚作用机制。阿司匹林通过COX环氧化酶的丝氨酸残基形成共价键从而抑制其活性的机理直到上市70年后才清楚^[2]。青霉素通过共价抑制起作用的机理直到上市后50多年后才阐明^[3]。

然而，共价抑制剂的开发当初并没有被看好。药物研发中曾普遍认为亲电试剂是药物设计的“禁区”，因为亲电试剂可能会导致很严重的脱靶毒性^[4]。Miller发现了一些化学物质和致癌作用之间的密切联系：某些惰性化学物质被机体代谢转化为亲电性活性代谢物，随后与蛋白质、脂质、DNA等生物大分子反应，导致细胞损伤。对乙酰氨基酚^[5]、溴苯^[6]和漆酚^[7]的毒副作用便是很好的例证（图2）。

图2. 引起毒性的活性代谢物的例子，突出显示亲电官能团

这些毒性引起了人们对药物中使用亲电官能团的担心。但近年来的研究发现，反应性较低的亲电试剂，如以丙烯酰胺基或腈基作为亲电官能团，通常是安全的，并且在临床上取得了很大成功。因此，建议在药物发现过程中，应仔细评估亲电官能团（发生共价结合的“弹头”）的亲电性^[8]。甜味剂三氯蔗糖和硫芥类药物，都带有烷基氯（图3）。三氯蔗糖作为食品甜味剂长期食用是安全的，但芥子气用于生化武器，其高活性氯会导致大分子（如DNA和蛋白）的非特异性烷基化。

图3. 两种分别含有惰性和活性烷基氯的试剂^[9]

随着反应性较低的“弹头”在临床上的应用，特别是靶向共价抑制剂（targeted covalent inhibitors，TCI）^[1]理性设计的成功，共价抑制剂迎来了蓬勃发展。截至22年7月，已经批准了超过110个共价抑制剂药物上市^[10]，涵盖了多个疾病领域，如青霉素为代表的抗生素用于抗感染，奥美拉唑为代表的质子泵用于胃肠消化道疾病，特拉匹韦等用于抗丙肝以及奥西替尼等靶向共价抑制剂用于抗肿瘤等（图4）。

图4. 代表性共价抑制剂药物

二、共价抑制剂的作用机制和体外药效评估

图5. 共价抑制剂的作用机制

共价抑制剂与靶蛋白的结合可分为两步，如图5所示，第1步是共价抑制剂与靶蛋白特定结合口袋发生非共价结合，形成非共价复合物。第2步是非共价复合物中共价抑制剂的“弹头”与靶蛋白中的亲核性氨基酸残基形成共价键，产生可逆或不可逆的共价结合，进一步增强抑制剂与靶蛋白的结合能力。

在通常小分子药物评估体外药效时，通常使用IC₅₀来表征活性。但是对于不可逆抑制剂，IC₅₀的参考价值有限。因为IC₅₀值是时间依赖性的，不同孵育时间会给出不同的IC₅₀^[11a]。为了有效评价共价抑制剂的体外药效，应该同时考虑上述第2步共价结合的动力学（图5）。k_inact/Ki是不可逆共价抑制剂的体外药效指标，而Ki/(1+k2/k-2)是可逆共价抑制剂的体外药效指标^[11b]。

三、共价抑制剂的DMPK性质

3.1 吸收

共价抑制剂一般分子量不大（500左右），大部分通过口服途径给药。如获批上市的质子泵类药物、抗丙肝药物以及靶向共价抑制剂等均是口服给药。可以用常规的体外筛选如Caco2评估其渗透性。部分青霉素类抗生素由于在胃酸条件下不稳定，通常是静脉滴注给药或肌肉注射^[12]。

3.2 分布

共价抑制剂与红细胞的蛋白共价结合，可能导致药物蓄积在红细胞内。如果取血浆测试药物的PK，可能导致IV给药经非房室模型计算出的PK参数清除率CL被高估，可能比肝血流量大。如下例子中的共价抑制剂在红细胞中的药物浓度是血浆中药物浓度的5倍，测出来的血浆清除率CL达到223 mL/min/kg，远大于小鼠的肝血流量（表1）。由于药物很大比例分配到红细胞里，根据非房室模型计算出来的分布体积也比较大。

表1. 小鼠红细胞和血浆

分配比为5的共价抑制剂在小鼠中部分PK参数

在动物PK实验中，测试全血和血浆中的药物浓度的时候，应该特别注意全血样品和血浆样品的处理。如果操作不当导致溶血，会引起全血和血浆的药物浓度不准。从而给PK参数的计算带来较大误差。另外，如果要测试全血样品，在全血样品的处理过程中，需确保添加适当比例的水完全裂解红细胞以彻底释放出药物，以保证生物分析结果的可靠性。

3.3 代谢

由于共价抑制剂独特的亲电结构，其体内主要清除途径除了细胞色素P450酶介导的代谢之外，与谷胱甘肽（GSH）的直接结合和/或通过谷胱甘肽S-转移酶（GST）催化的GSH的结合可能也是其在体内的主要清除途径。因为GSH大量存在于细胞中，浓度为0.5-10 mM^[13]；谷胱甘肽S-转移酶（GST）在全身广泛存在，在细胞胞浆、微粒体和线粒体内均有发现^[14]。其中肝胞质溶胶主要含有alpha和mu类亚型。Pi类亚型主要分布在其他组织如胃肠道、心脏、肾脏、肺、皮肤和红细胞中^[15]。

在缓冲液中开展GSH的结合反应，可用于评估共价抑制剂“弹头”的化学活性和体内非酶清除的途径，如图6表示^[16]，所得的代谢产物有M+305和M+307两种类型。体外谷胱甘肽S-转移酶（GST）催化的GSH结合能模拟体内GST酶催化的GSH的结合情况，此时可以在肝脏细胞胞浆中孵育时加入GSH。但有GST酶的催化作用，并不一定比没有酶催化反应更快,这种情况发生可能是由于药物在胞浆中高结合保护药物而降低代谢。更详细的判断是否生成了GSH加合物可以通过代谢产物鉴定进行。如图7所示，在负离子模式下，GSH加合物产生的特征碎片包括306.0765，272.0888，254.0782，210.0884，179.0462，143.0462等。通过采集特征离子流如[SIM 272.0888]的信号来进行初步判断是否有GSH加合物，再通过二级碎片进一步确认。 

图6. 体外GSH反应评估“弹头”的活性

图7. GSH加合物在负离子模式下的特征离子碎片

除了GSH之外，半胱氨酸也是一种评估作用于巯基“弹头”活性的亲核试剂（图8）。以腈基底物为例，其与蛋白质硫醇在体内的反应可以是可逆的，而与半胱氨酸或含小半胱氨酸的肽的反应可以以不可逆的方式进行。通过定量测量腈基底物与小分子硫醇的反应速率，可以提供一种简单的途径来对其固有反应性进行评级。腈基底物与半胱氨酸的反应比与谷胱甘肽的反应要快得多，MacFaul等对两者反应速率之间总结了相关性（图9）^[17]，两者的反应速率大体呈现正相关。

图 8.（a）蛋白质硫醇和腈基底物发生可逆反应。（b）腈基底物与半胱氨酸反应^[15]

图9. 腈基底物与谷胱甘肽和半胱氨酸反应速率的比较

（虚线斜率为1，截距为1.2）^[17]

由于谷胱甘肽更具生理相关性，其反应速率应优先用于体外评估。化合物与谷胱甘肽非常快速的反应可能会通过耗尽谷胱甘肽或通过与蛋白质的不可逆共价结合而导致潜在的毒性风险^[18]。

由于共价抑制剂与GSH之间的反应活性，肝外组织或肝脏的GSH可以在GST酶的催化作用下与共价抑制剂发生加成反应。某些GST酶，如mu1亚型酶，在人类中表现出了基因多态性。因此，如果被GST mu1催化的GSH结合是共价抑制剂的主要清除途径，不同个体可能表现为“慢速”和“快速”代谢表型^[19]。药明康德DMPK部门能提供GST的重组酶来评估GSH反应性，包括GSTA1、GSTM1和GSTP1等3种重组酶。

3.4 排泄

部分抗生素类的共价抑制剂由于极性较大且水溶性好，其在体内的主要排泄途径是以原药形式通过肾脏排泄^[12]。其他类的共价抑制剂没有表现出明显的排泄方面的特性。

3.5 药物相互作用

在药物抑制方面，许多共价抑制剂是人CYP酶的时间依赖性抑制剂（如表2所示）。大多数化合物显示出对至少一种酶的时间依赖性抑制(Time Dependent Inhibition, TDI)。孵育浓度为5 μM时，提前预孵育30分钟相较于共孵育条件下，Dacomitiniby是最显著的时间依赖性抑制剂，CYP2C8的抑制率偏移约30倍，其次是Telaprevir（CYP2C8的抑制率偏移约14倍）、Boceprevir（CYP1A2的抑制率偏移约9倍）和Canertinib（CYP3A4/5的抑制率偏移约8倍）。因此共价抑制剂应该在开发的早期阶段评估时间依赖性的药物相互作用^[20]。

表2. 多个共价抑制剂的体外时间依赖性抑制^[20]

3.6 人体清除率预测

基于18个JAK3激酶共价抑制剂的体外肝细胞和全血稳定性等数据，Leung等通过建立合适的模型，分别对应预测这些抑制剂的体内肝脏清除率和肝外清除率，从而推算出这些药物在人体内的总清除率CL^[21]。体外肝细胞代谢稳定性主要预测P450和GST（主要为alpha和mu亚型）酶介导的肝脏清除率CL_h，而全血代谢稳定性主要预测肝外GST（主要为pi亚型）介导的清除率CL_eh。

如图10所示，根据全血稳定性数据可以计算体外全血清除率，从体外全血清除率推测人体肝外清除率CL_eh。总清除率CL即为肝脏清除率CL_h和肝外清除率CL_eh之和（方程1）。

图10. JAK3激酶共价抑制剂的体外全血稳定性预测肝外清除率

Leung等通过以上方式提供了一个预测共价抑制剂人体清除率的方法并能得到很好的验证。如果能获取更多数据，如化合物在人体GST重组酶中的稳定性，结合人体体内GST相关的生理学数据可以采用PBPK模型预测人体总清除率。

3.7 PK/PD

对于非共价抑制剂而言，非共价抑制剂与靶标形成快速平衡，药物的PD活性和PK直接相关，可以通过提高药物的暴露量提高药物的生理活性。共价抑制剂与靶标形成共价键是非平衡步骤，PK和PD之间通过共价抑制剂和靶蛋白的结合动力学（binding kinetics, BK）作为桥梁联系起来。共价抑制剂即使在血浆中被清除，但靶蛋白可能仍然被抑制，而新的靶蛋白尚未合成出来，所以仍然在发挥药效（图11）。因此，如果两者具有相似的PK参数，共价抑制剂会表现出更长的药效（适用于靶蛋白的半衰期比药物半衰期长的情况）（图12）。由于共价抑制剂的药效由峰浓度驱动，理想的PK性质是达峰浓度高，达峰时间短（吸收迅速），药物血浆清除率高等。理想的共价抑制剂药物可以以较低的剂量给药，具有降低给药频率，减少脱靶事件和毒性等优点。

图11. 共价抑制剂的药代动力学（PK）、结合动力学（BK）和药效学（PD）的关系^[11b]

图12. 具有相同PK参数的共价抑制剂和非共价抑制剂的药效持续时间比较^[11a]

在谈到共价抑制剂的药效，不得不提靶点占有率。共价抑制剂在靶点发挥药效，需要一定的靶点占有率，靶点占有率越高，发挥的药效越强^[10a]。Evans等报道了靶向BTK的共价抑制剂CC-292在健康志愿者中的药代动力学和药效学研究^[22]。对服用CC-292的六名受试者的药代动力学分析表明，CC-292吸收迅速，药物在血浆中的半衰期为1.9小时，在4小时时BTK的占有率最大（平均靶点占有率97%），BTK 蛋白的半衰期为48-72小时（图13）。BTK抑制剂伊布替尼在人体受试者中口服给药的半衰期是3小时，但在每日给药420 mg后24小时内具有>95%的靶点占有率^[23]。对于共价抑制剂而言，靶标占有率-药效动力学相关性取代了传统的药代动力学-药效动力学（PK/PD）相关性。药效持续时间与靶向酶的半衰期直接相关，而和药物的半衰期没有直接联系。

图13. 共价抑制剂CC-292在健康志愿者中的药代动力学和药效学^[19]

总结与展望

表3总结了共价抑制剂的特性以及与常规小分子药物的区别。随着共价抑制剂成功应用于难成药靶点如KRAS G12C，共价抑制剂展现了独特的优势。当然，共价抑制剂也存在缺点，比如耐药性。EGFR和BTK共价抑制剂结合位点的半胱氨酸容易发生突变，会导致共价抑制剂的失效。除了最常见的靶向半胱氨酸残基，其他氨基酸残基也在开发为共价抑制剂的靶标，如赖氨酸^[24]、天冬氨酸^[25]等。共价抑制剂在其他难以成药靶点如蛋白相互作用领域也被寄予厚望^[26]。

表3. 共价抑制剂与非共价小分子药物性质比较

作者：程起干，金晶

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1500个新药临床研究申请（IND）。 

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