抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugate，ADC）是指通过连接子将小分子化合物偶联至靶向性抗体或抗体片段上的一类生物技术药物。ADC在靶组织中有效释放其荷载小分子化合物（荷载分子，Payload）的能力和在非靶组织、循环系统的稳定性，是药代动力学重点关注的内容。药明康德药性评价部代谢产物鉴定团队在美国药理学和实验治疗学会（American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics, ASPET）旗下期刊Drug Metabolism and Disposition上发表了一篇关于不可裂解型ADC体外代谢产物研究方式的文章，建立了系统性研究不可裂解型ADC在体外孵育体系中释放荷载小分子化合物形式的质谱分析和数据处理方法。本文将从研究模型、分析方法和案例解读此篇文章的内容。
一、研究背景及研究模型
根据连接子（linker）的不同，ADC可分为可裂解型和不可裂解型。可裂解型ADC一般通过连接子与荷载分子之间的化学键断裂，直接释放出荷载分子或其进一步代谢的产物；不可裂解型ADC没有特定的连接子断裂释放，而是通过抗体的完全或部分水解（catabolism）后释放出荷载分子相关的小分子。对于新研发的ADC，其荷载分子释放形式具有未知性，发现和鉴定荷载分子的主要释放形式，可以为后续的药物药物相互作用和动力学实验的有效定量提供依据。
此篇文章建立了用于荷载分子相关产物的定性分析方法。由于ADC药物释放出的小分子毒素浓度很低，且不可裂解型ADC的裂解产物难预测，在检测中存在诸多挑战。常用于小分子代谢产物鉴定的质量亏损过滤和靶向性预测提取离子流的数据处理方式，对于ADC的分析有一定的局限性，而放射性同位素标记法实验成本又过于高昂。
文章以T-DM1和ADC-1作为研究对象分别以酸性肝S9、酸性肝溶酶体以及肿瘤细胞作为体外孵育体系，研究荷载分子相关成分的释放。
二、分析方法
如下图所示，采用UPLC-UV-HRMS分析平台，通过全扫描和二级质谱扫描模式，使用非靶向性的背景扣除方法及靶向性的预测产物提取离子和特征子离子过滤法进行数据分析。
图1. UPLC-UV-HRMS分析平台分析不可裂解型ADC的流程
小分子代谢产物鉴定分析软件主要使用靶向性的提取离子流法，此方法是基于特定的原药化学结构和常见的代谢途径预测可能的代谢产物，并在图谱中进行提取比对，匹配出可能的代谢产物。
非靶向性分析的逻辑是：与空白对照样品对比，只存在于供试品样品中的成分会是可能的代谢产物。小分子药物的代谢产物研究通常使用特征紫外吸收波长下的液相色谱-紫外图（Liquid Chromatograph-Ultraviolet，LC-UV）来发现可能的产物紫外峰，或运用背景扣除技术处理LC-MS图谱，获得一张扣除了基质成分的LC-MS图，从而将产物的质谱信号从复杂的基质背景信号中凸显出来，并通过二级质谱解析确认其分子结构。因为不可裂解型ADC是在溶酶体/S9中完成抗体蛋白水解后释放出荷载分子相关小分子，所以在ADC的代谢研究中会使用对应的单克隆抗体替代ADC的孵育样品作为对照，可以帮助排除裸单抗水解产生的蛋白片段的干扰峰。
特征子离子过滤分析（Product Ion Filter, PIF）也是一种常见的代谢产物筛选方式，其逻辑是基于原药的特征碎片，在LC-MS2中搜索含对应碎片的相关成分，其优点在于可以发现非常规代谢途径/不可预测元素组成变化的代谢产物，在数据依赖型采集（DDA模式）下如果可以获得二级质谱时，可以直接从二级质谱找到其母离子的归属。特征子离子过滤分析可以作为一个数据筛选和图谱获取的补充方法。
三、案例解析
案例一：T-DM1在体外溶酶体中释放的荷载分子相关降解产物的分析和鉴定
图2. T-DM1的结构示意图
文中首先以不可裂解型ADC，T-DM1作为研究对象。T-DM1是以美登素衍生物为荷载分子，通过连接体在抗体的赖氨酸残基位点形成偶联。T-DM1和相应的抗体分别放在酸性的人溶酶体孵育体系中孵育48小时，通过高分辨质谱仪采集一级和二级数据。如下图所示，T-DM1在酸性溶酶体中孵育后，得到LC-UV、LC-HRMS及经背景扣除处理后的样品LC-HRMS图。
图3. T-DM1 在酸性溶酶体孵育后的（A）LC-UV；（B）LC-MS和（C）背景扣除的LC-MS（D）特征子离子（m/z 547.2207）提取离子LC-MSMS和（E）所有检测到的产物的提取离子流色谱
如图所示，T-DM1所释放的主要降解产物为赖氨酸残基-连接子-荷载分子（图1的L7/L8），与其他相关文献报道的结果一致，证实了体外代谢体系及检测方法的可靠性。除主要降解产物外，通过背景扣除的方法（precision and through background subtraction，PATBS）处理后还检测到次要的荷载分子相关代谢产物（L9/L10），经质谱鉴定为酪氨酸残基-连接子-荷载分子，表明有部分荷载分子的偶联位点在酪氨酸残基上，该结果体现出非靶向的数据处理技术可以帮助发现未知/预测之外的降解产物。此外还通过特征子离子提取（Product-Ion-Filter, PIF）的技术，通过荷载分子上的特征碎片 （质荷比547.2207），在LCMS上找到了多个三肽残基（偶联位点在抗体蛋白的不同序列片段上）的产物（L1-L6）。
图4. T-DM1的肝溶酶体中释放的荷载分子相关产物的二级质谱碎片和结构解析:（A）L7（B）L9（C）L5（D）L1
案例二：ADC-1在体外酸性肝S9和肿瘤细胞中释放荷载分子相关降解产物的分析和鉴定
图5. ADC-1的结构示意图
用与T-DM1同样的检测方法应用于分析未知药物ADC-1在酸性肝脏S9孵育的样品，ADC-1由荷载分子MMAF和新的抗体组成，偶联位点为半胱氨酸。将其与肝S9孵育48小时后，用LC-HRMS获得了全扫描色谱图（见下，A图），但是由于从ADC1所释放的荷载分子相关产物浓度较低，受基质干扰较为严重，与空白对照组（B）相比，A图没有显示出荷载分子相关产物。而通过双重背景扣除数据处理（依次扣减空白对照组和０时间样品的基质图谱），有效地去除了基质干扰信号，所获得全扫描LC-HRMS色谱图（C、D图）显示M4为主要降解产物。根据其一级质谱和母离子在用数据依赖性方法采集的MS/MS数据中获得的MS/MS图谱，以此解析了M4是Cys-MC-MMAF的结构，从而确认了ADC-1中连接小分子荷载分子的位点和荷载分子的释放机理。除了M4还检测到了3个Cys-MC-MMAF相关的代谢产物（二肽残基-MC-MMAF和MC水解物-MMAF）。
图6. ADC-1在猴肝S9孵育48h后样品的LC-HRMS 图谱. (A) ADC-1 样品的质谱基峰色谱. (B) 单抗对照样品的质谱基峰色谱 (C) ADC-1 扣除单抗对照后的质谱基峰色谱. (D) ADC-1 扣除单抗对照和0时间样品后的质谱基峰色谱
在研究了S9中ADC-1的释放情况后，进一步研究了其在肿瘤细胞培养体系中的代谢释放情况。人乳腺癌细胞48h孵育后，产物释放浓度很低，在LC-MS的总离子流色谱上代谢产物相关的峰在背景基质中不可见（A），通过背景扣除技术处理过的LCMS图谱上发现了低含量的代谢产物峰M4（Cys-MC-MMAF）证明了方法的有效性。
图7. ADC-1 在肿瘤细胞孵育后的（A）LC-HRMS和（B）背景扣除的LC-MS图谱
总结
此篇文章的亮点是系统性的构建了不可裂解型ADC释放的荷载分子相关水解产物的LC-HRMS研究方法，通过靶向性与非靶向性结合的质谱数据处理方法寻找和鉴定ADC释放的荷载分子相关小分子，具有全面和高效的优势。进一步通过研究案例说明：靶向性和非靶向性相结合的LC-HRMS分析技术是发现和鉴定ADC所释放的未知荷载分子相关产物并进一步推测其代谢途径和释放机理的有效方法，且可用于体外肝溶酶体和S9等亚细胞结构孵育体系以及肿瘤细胞孵育体系的体外代谢研究模型。
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作者：施立琦，李瑞兴，曹卫群
编辑：方健，钱卉娟
设计：倪德伟
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