非特异性吸附的产生和解决策略解析

非特异性吸附（Nonspecific binding）实际是一种非共价键作用力导致的吸附作用。溶液中的待测化合物因为静电作用或化合物的疏水作用被吸附到固体表面。吸附问题贯穿于整个药代动力学实验过程中，在制剂配制、实验动物给药、样品采集和储存到最后的生物样本分析检测等阶段都可能存在这种吸附现象。吸附不仅会影响制剂配制和样品的真实浓度，还会导致定量时标准曲线的提取回收率不一致，出现高浓度点信号偏高，低浓度点信号偏低的现象。在仪器分析阶段，吸附还会影响色谱峰型以及产生进样残留，从而影响结果的精确性。本文将基于非特异性吸附产生的原理，结合部门经验，对解决吸附问题的一般途径和思路进行介绍。

一、非特异性吸附的三要素

待测化合物是否存在吸附现象和吸附程度，与溶液接触的固体表面、溶液的组成、以及待测化合物的性质息息相关，以下将从药代动力学实验的角度分别介绍这三个要素。

图1. 非特异性吸附的三要素

1.1 固体表面的类型

实验过程中溶液接触到的固体表面主要有玻璃器皿、聚丙烯等塑料耗材以及液相色谱的管路和色谱柱等，相应的吸附原理也有所不同，如表1所示。

表1. 不同材质表面的吸附原理

1.2 溶液的类型

溶解待测化合物标准品或配制给药制剂时，溶剂的成分主要为水、有机溶剂或分散剂等。对于小分子待测化合物来说，在这些溶剂中溶解度较好，吸附作用相对较弱。而生物基质中组分较为复杂，例如血浆中除了含量最多的水以外，富含血浆蛋白，还有磷脂等脂类物质，小分子药物会与血浆蛋白相结合，脂类也可以减弱待测化合物的吸附现象。因此在全血、血清、血浆这些基质中，小分子待测化合物的吸附作用也相对较弱^[1]。而尿液、胆汁、脑脊液这类体液中由于蛋白和脂类浓度相对较低，产生非特异性吸附的概率大大提升。

1.3 待测化合物的类型

部分小分子药物可能会在尿液、胆汁这些排泄样品和脑脊液等基质中存在吸附，而大分子药物比如多肽、蛋白、PDC、核酸类药物和阳离子脂质等类型的化合物，存在吸附的场景就更多一些，这与药物分子的结构有关。

多肽、蛋白、PDC类化合物的主体结构都是由氨基酸组成的，氨基酸既带有正电荷氨基也存在带负电荷的羧基，是一种两性化合物，静电作用很强^[2]。而某些氨基酸比如赖氨酸、精氨酸和组氨酸的R基中还额外带有氨基、咪唑基和胍基等带正电荷的基团（如图2所示），加上这些分子的结构相对较大，多肽蛋白和PDC类化合物的静电作用和疏水作用更为明显，不仅在尿液胆汁这些基质中存在吸附，此类化合物在血浆中，甚至在配制仅含有机试剂的工作液的过程中也会受到吸附的影响。

图2. 部分氨基酸残基带有正电荷基团产生静电作用吸附

核酸类药物由碱基、核糖或脱氧核糖，还有磷酸组成，也是一种两性的分子，嘧啶和嘌呤这些碱基本身就含有较多的氨基基团，而磷酸基团则容易吸附在金属表面^[3]。

图3. 核酸中五种常见碱基具有正电荷基团

阳离子脂质也具有两性化合物的性质，以DOTAP（（2,3-二油氧基丙基）三甲基氯化铵）为例，它是由具有正电荷的季铵盐头部，通过酯键的连接片段，与长链的尾部相连。头部会引起较强的静电作用，而尾部则会产生疏水作用，吸附现象也尤为明显^[4]。

图4. 阳离子脂质DOTAP结构。

头部具有静电作用，尾部产生疏水作用

1.4 影响吸附的其他因素

非特异性吸附的三要素决定了是否存在吸附，而一些其他因素如环境温度，溶液pH值，溶液与固体表面接触的时间，甚至溶液的冷冻融化次数等情况都会对吸附程度有一定影响，这就需要在实验过程中根据实际情况进行考察。

二、解决非特异性吸附的一般途径

待测化合物在溶液中与耗材或管路表面接触的表面积越大、接触时间越长，吸附程度便会更加严重^[5]。基于这个原理，考察非特异性吸附的方法常用的有连续转移法、梯度稀释法等，也可以通过对比相同体积溶液置于不同规格的容器中，或对比不同体积溶液置于相同规格容器中的信号差异来判断是否存在吸附，以及吸附的程度。

针对不同的生物基质类型，通常会在基质中加入解吸附剂以达到解吸附的作用。药明康德药性评价部总结出不同生物基质的一般解吸附途径如下表（表2）。

表2. 不同生物基质的一般解吸附途径

表面活性剂一端带有亲水基团，另一端具有疏水基团。表面活性剂的加入会使待测化合物在溶液中分散的更均匀，从而改善溶解状态，同时减弱了产生非特异性吸附的疏水作用力^[6]。而在待测化合物的质谱分析过程中，表面活性剂的引入通常也伴随着不同程度的信号抑制或干扰。因此对于不同的化合物需要筛选合适的表面活性剂，既要能起到解吸附的效果，又要避免对待测化合物检测产生影响。常用的表面活性剂如下表（表3）。

表3. 表面活性剂的分类

在样品采集和前处理过程中，除了加入解吸附剂的方式外，还可以通过使用低吸附耗材来配合减弱吸附作用。如针对蛋白和核酸类化合物设计的低吸附管，低吸附96孔板等。而在分析检测过程中，除了常规的液相质谱仪器外，药明康德药性评价部还拥有经过表面钝化处理的低吸附色谱柱和液相系统平台，对磷酸化的化合物（图5）和核酸类药物（图6）都有较好的峰型表现和信号提升作用，赋能客户药物研发。

图5. A)AMP和ATP的结构式，B)使用低吸附液相系统及色谱柱，峰型对称；C)使用常规液相系统，峰型拖尾严重。

图6. A) 硫代磷酸酯修饰的核酸类药物结构式，B) a, 常规液相系统; b, 低吸附液相系统，信号增长近10倍

三、新分子药物的非特异性吸附解决策略

对于多肽、蛋白、核酸类新分子类型的药物研究中，药明康德药性评价部也通过积极研究和不断摸索，针对性地总结出各分子类型分析平台对于非特异性吸附问题的解决策略（表4）。

表4. 新分子类型的非特异性吸附解决策略新分子药物类型吸附问题解决策略

多肽、蛋白、PDC类药物吸附作用明显，根本原因在于溶解度较差，通过调节溶解溶剂的pH值，优化溶解溶剂种类和组成可以在一定程度上改善化合物溶解状态，减弱吸附作用。同时，由于这些化合物在液质系统中信号响应较低，为了满足灵敏度要求，对于解吸附剂的筛选和比例的优化尤为重要。

我们同时也搭建了核酸类药物的检测平台，核酸类药物在设计时通常会进行骨架的磷硫修饰，如图7所示，这不仅仅提高了在基质中的酶稳定性，同时提高了核酸药物与血浆蛋白的结合率，从而起到减弱非特异性吸附的作用。除了前面所述加入解吸附剂的方式以外，在流动相中添加EDTA等螯合剂，调节流动相的pH值，一定程度上也可以减弱金属管路与色谱柱对于核酸类药物的吸附作用^[7]。最后还可以使用低吸附的色谱柱和液相系统来提高核酸药物的回收率，降低检测下限。

图7. 核酸类药物磷硫骨架和糖基修饰

药明康德药性评价部凭借多年的药代动力学实验基础，不断开拓创新发展出多肽、蛋白、PDC和核酸类等新分子类型药物检测平台，搭建起为客户赋能的药性评价团队，助力药物分析，推动药物研究进程。

结语

化合物产生非特异性吸附会影响其药代动力学实验结果的准确性。因此我们需要在实验全流程中根据待测化合物的性质，选用合适的溶媒、溶剂，优化样品采集和储存条件，找到合适的生物样本前处理流程，确保待测化合物在药代动力学实验过程中状态保持稳定，最终得到准确、有效的结果。

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。 

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参考文献：

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[2] Chambers E E, Legido-Quigley C, Smith N, et al. Development of a fast method for direct analysis of intact synthetic insulins in human plasma: the large peptide challenge[J]. Bioanalysis, 2013, 5(1): 65-81.

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作者：何玟辉，陈丹，高峥贞，卢金莲，邢丽丽

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟