高蛋白结合药物PPB测定：动态透析法的原理及优势

随着多种新分子实体药物的迅速发展，当前的药物化学设计出现了越来越多超越类药五原则（Lipinski规则）的分子类别，如蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC），它们往往具有一些共性，如分子量高、亲脂性强、水溶性差、非特异性吸附严重等等，表现出很高的血浆蛋白结合（plasma protein binding, PPB），导致准确测定PPB十分困难^[1]。本文介绍了一种测定非常高蛋白结合化合物PPB的方法——动态透析法（又名通量透析法，Flux dialysis），阐述了该方法的原理、数学模型，展示了我们的验证实验数据，并解读部分关键的数学公式推导与证明过程。

一、背景

血浆蛋白结合（PPB）是药物发现和开发领域中颇有争议的议题之一。通常情况不建议通过优化结构来改变候选药物的PPB，因为PPB本身与体内的药效几乎没有相关性，对体内游离药物浓度的影响非常小^[2-4]。非常高结合的化合物在多数情况下并不意味着它是一种好的或不好的化合物。但是PPB实验测到的参数游离分数（fraction unbound，f_u）却是一种需要准确测定的关键参数，它对于预测药物相互作用（DDI），估计治疗指数（TI），开发PK/PD关系具有重要的作用^[5]。

测定化合物在生物基质中的游离分数有多种方法，如平衡透析法、超速离心法、超滤法等，其中平衡透析法是最常用的方法。然而，只有当体系达到真正的平衡、化合物在生物基质中没有发生代谢或降解，且缓冲液中游离样品的浓度满足分析灵敏度的要求时，平衡透析法测试得到的f_u才是可靠的。

图1. 平衡透析法的原理示意图^[6]

(a) 0时刻，将药物加入生物基质——血浆或脑匀浆中；

(b) 经过4-6小时的透析后，体系无非特异性吸附，药物在膜两侧达到平衡的情形 ；

(c) 体系存在非特异性吸附，化合物在膜两侧仍然可以达到平衡的情形。

对于高蛋白结合的化合物，往往需要很长的时间达到平衡，甚至在有些情形下达不到平衡，导致准确测定fu十分困难。由于f_u难以被准确测定，FDA^[7]和EMA^[8]的DDI指导原则中对PPB f_u的可测量下限进行了规定，当血浆游离分数小于0.01时，按照0.01进行估计，对于高结合的化合物可能会导致DDI效应被高估。最近几年业内的专业期刊发表了多篇文章优化PPB测定的方法，用来更加准确的估计f_u^[9]。其中，动态透析法就是基于平衡透析的原理开发出的一种方法。

二、动态透析法原理及方法简介

动态透析法并不是一种在实践中经常使用的方法，最早在上世纪五十年代开发出来。它可以克服平衡透析的一些局限，测定到更低的f_u。

基本方法为：用加入化合物的血浆样品，与空白血浆进行透析，如果化合物在透析膜中的通透系数是已知的，化合物在基质中的游离分数可以用化合物渗透进入接收室的初始通量速率计算得出。

基本原理是：化合物透过透析膜的初始通量速率与初始浓度，f_u和膜通透系数的乘积成正比。通过这种方式，无需在平衡态测定平衡浓度，仅需根据浓度曲线图求得其初始斜率，即可计算出f_u。这样就绕过了必须取得平衡的限制，对于高蛋白结合化合物的PPB测定具有很强的应用意义。

然而由于多方面原因，如需要测定膜渗透性、取样时间点多、实验过程繁琐、需要更高放射性纯度的化合物等，该方法并未在实践中大量应用。随着高通量实验装置的普及、药物动力学模型的建立和发展，该方法的操作性也得到了改进，目前在药明康德DMPK该方法已被实际运用。

后来美国艾伯维公司研发团队的研究人员对这种新的动态透析法的理论模型进行了详细的数学证明^[10]，下面我们简要介绍其中的部分关键内容。

三、动态透析法的动力学建模

下面介绍的是本方法求解f_u的理论基础。化合物在给药室和接收室的浓度变化可以通过图2建立的二室模型来描述。

图2. 透析动力学模型^[11]

X₀：初始加入的药物量，V：房室体积，P_mem：透析膜通透系数，A：膜表面积，K_nsb:非特异性吸附结合的结合常数，C：浓度，K_loss：化合物降解的一级动力学速率常数

当不考虑K_nsb和K_loss时，由该模型可推导出f_{u, donor}与R_slope成正比（R= C_receiver/C_donor，R_slope为初始时刻t=0时，浓度比相对于时间的导数，即dR/dt），当获得R_slope 值即可求得f_{u, donor。}

（具体推导过程见文末）

然由于t=0时的R_slope难以直接通过实验准确得到，因此采用不同时间点的R值根据公式(b)进行拟合，绘制R-t曲线图，进一步求得曲线初始斜率，也可得到Rslope 值。

（具体推导过程见文末）

通过R-t多时间点的实验数据拟合出完整的R-t曲线后，即使早期的时间点数据有缺失，仍然可以较为准确的计算出R_slope。

当K_loss无法被忽略时，进一步假定两侧基质降解速率一致，且降解过程符合一级动力学，通过数学推理可知R-t的理论公式为公式（c），该公式与K_loss无关，因此flux方法同样适用于在基质中不稳定的化合物。

（具体推导过程略）

四、实验验证结果

根据上述动态透析法的理论，化合物无需在透析装置中完全达到透析平衡，即可以准确测定它的游离分数。我们选择了一些商品化合物进行动态透析法的实验验证，其中18个化合物在人血浆中进行测试,得到人血浆中的游离分数（f_up）；9个化合物在大鼠脑组织匀浆中进行测试，得到脑匀浆中的游离分数（f_ub）。实验结果的相关性良好，拟合优度R²值均大于0.98。

图3. 18个商品药物在人血浆中的游离分数（fup），动态透析法测定结果与文献报道对比

横坐标为我们实验室的动态透析法测试数据（Inhouse fup），纵坐标为文献值（Literature fup）。验证实验的化合物为Afatinib，crizotinib，ibrutinib，osimertinib，aspirin，enalapril, imipramine，indomethacin，itraconazole，lapatinib，quinidine，sertraline，amiodarone，montelukast，mifepristone，rosiglitazone，ritonavir，nicardipine。

图4. 9个商品药物在大鼠脑组织匀浆中的游离分数（fub），动态透析法测定结果与文献报道对比

横坐标为我们实验室的动态透析法测试数据（Inhouse fub），纵坐标为文献值（Literature fub）。验证实验的化合物为Verapamil hydrochloride, propranolol, saquinavir, nicardipine, paclitaxel, fluoxetine, carbamazepine, chlorpromazine, sertraline hydrochloride

图5. 几个代表性化合物的R-t曲线

五、本方法的优势

我们在文献的基础上建立并验证了动态透析这种方法。与常规的平衡透析法实验设计相比，动态透析法具有如下优点：

1. 测定准确的f_u所需的理论透析时间短。对于一些类型的化合物，采用常规平衡透析法可能需要更长时间，甚至更长的时间也无法达到平衡；

2. 方法不受非特异性吸附和基质中稳定性的影响；

3. 样品测试时对分析方法的灵敏度要求不高；

本方法可用于非常高结合率化合物的蛋白结合率测定，并通过R-t曲线对同系列化合物的结合率数值进行分类排序。

六、部分公式的推导过程

公式a推导过程：

根据上述模型，可知在忽略K_nsb和K_loss时，donor和receiver两侧药物量分别为：

在0时刻，认为给药室的浓度近似等于初始的浓度，则:

令flux（化合物渗透进入receiver端的通量速率）为公式3：

当体系到达稳态（t→∞），给药室与接收室两侧游离的药物浓度相同，则：

令R= C_receiver/C_donor, 稳态时候的R, 即R_eq为

由于当t=0时Cdonor可被近似为常数，由公式（3）可得

令t=0时的dR/dt 为R_slope，则

由此可知，f_{u, donor}与R_slope成正比。P，A和V是与实验装置有关的参数，皆为常数，可以通过已知f_u值的化合物的实验数据求解得到。我们通过实验获得初始条件下的R值，拟合得到初始条件下的斜率，即可计算出fu。

公式b推导过程：

R(t)函数的代数表达式需要通过对公式1和2的微分方程组进行求解得到。原文献中并未给出求解的详细推理过程，直接给出了结果：R(t)函数解析式。为了使这个过程更加容易理解，本文我们给出了两种求解方法： 

（1）通过拉普拉斯变化分别得到给药室和接收室中浓度对时间变化的两个函数【C_donor(t) 和C_receiver(t)】各自的象函数F(s)，经过一定的计算后，通过逆变换求出原函数的表达式（参见下面的公式A15 和A16），再将C_receiver(t)和C_donor(t)作比值即得到R(t)函数的解析式。

（2）微分的四则运算法则:

dR/dt 即C_receiver(t)和C_donor(t)的商的微分可以套用上面的公式，而C_receiver(t)和C_donor(t)的微分方程即公式1和2，经过运算化简后得到：

再进一步通过拉普拉斯变换法对方程两侧进行变换，得到:

进一步求解这个方程，得到：

也就等于上述的公式b：

结语

在药代动力学领域的研发项目中，针对高结合化合物，提高PPB测试的准确性是一项十分重要的任务。在药明康德DMPK，我们已经开发和验证了多种正交实验方法来确保这些化合物 PPB 测量的准确性，并持续赋能客户的新药研发项目。

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。 

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作者：王洁，孙子茜，王翔凌，陈根富

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟