如何采用体外代谢模型研究慢代谢化合物

体外代谢稳定性研究已被广泛应用于药物发现，以确定化学序列，指导结构修饰，开发药物构效关系，预测体内清除率，建立体外体内相关性（IVIVC）和预估人体给药剂量。随着有效的药物设计策略实施，药物化学家会通过优化结构来封闭代谢位点，因此越来越多的化合物表现出较低的清除率数值^[1-3]，我们称这类化合物为慢代谢化合物，研究该类化合物需要很长的孵育时间且研究体系需要具有很好的酶活性，其体外研究具有很大的挑战性。

本文针对该挑战建立了相关的体外研究模型，同时根据其慢代谢化合物的特点或者研究目的可以给出合适的模型选择方法。

一、体外代谢研究模型

肝微粒体和悬浮肝细胞是体外最常用的研究代谢稳定性的模型。肝微粒体的优势在于其代谢酶（尤其是细胞色素P450酶）丰富，使用方便，成本相对较低。悬浮肝细胞也被广泛应用于药物发现和开发，因为它拥有更完整的药物代谢酶和辅助因子，因此可用于不同的代谢清除途径研究。除CYP酶之外，肝细胞还包含Non-CYP酶，例如，葡萄糖醛酸转移酶（UGT）和醛氧化酶（AO）等。

由于药物代谢酶活性随着体外孵育时间增加会逐渐降低，体外研究中，肝微粒体通常孵育时间最长为1小时，悬浮肝细胞孵育时间最长为4小时。这样的孵育时间不足以使慢代谢化合物产生足够被检测到的代谢反应，所以传统的体外代谢研究模型在预测慢代谢化合物的清除率及其代谢产物方面存在局限性^[4]，需要建立延长孵育时间同时维持体系酶活的方法。

目前，慢代谢化合物主要研究方法^[3-7]如下：

1. 贴壁肝细胞孵育体系方法：可以将孵育时间延长至48小时，如果加入HepExtend培养因子，可以将时间延长至一周并保持正常的酶活；

2. 悬浮肝细胞接力（Relay）方法：应用悬浮肝细胞，孵育时间可延长至20小时甚至更长；

3. 肝细胞和基质细胞共孵育体系：目前2种成熟的商品化模型为HμREL和HepatoPac模型，孵育时间可延长至72小时

4. HepaRG孵育体系：利用人肝癌细胞系进行研究，孵育时间可延长至24小时。

图1. 慢代谢化合物主要研究方法

对于上述的4种方法，贴壁肝细胞因其完整的转运体表达，悬浮肝细胞relay方法因其种属选择灵活，二种方法均有好的体内-体外相关性，且获取便利，本文优先对这两种方案进行详细介绍。

二、贴壁肝细胞孵育方法

肝细胞代谢稳定性实验流程

细胞复苏：从液氮罐中取出冻存细胞，放入37℃水浴锅中融化，轻柔离心后收集细胞沉淀；

细胞计数：加入孵育培养基稀释到合适的细胞浓度，进行细胞计数；

细胞铺板：将稀释好的肝细胞悬液加入到对应的孵育细胞板中；

孵育：加入化合物工作液后开始不同时间点孵育，待时间点孵育结束，加入终止液终止反应，继而离心取上清，进行LC-MS/MS检测。

 图2. 肝细胞代谢稳定性流程

贴壁肝细胞的方法验证

肝细胞培养方式

a.单层培养：肝细胞种在胶原包被的细胞板上，形成胶原-肝细胞-培养基的单层模型。

b.“三明治”培养^[8]：肝细胞种在胶原包被的板子上，待贴壁之后，再加入一层基质胶，形成胶原-肝细胞-基质胶的三层模型，肝细胞在中间层，这被称为“三明治”模型。

图3. 肝细胞培养方式

贴壁肝细胞孵育体系验证^{[4, 8, 9]}

a.慢代谢商品化化合物选择：

选择以下5个慢代谢化合物进行验证，其代谢酶包含CYP酶、UGT酶和MAO酶，其中Atorvastatin是转运体OATP1B1的底物。

表1. 慢代谢化合物选择和其代谢酶

b.实验数据展示：

• 清除率数据

3个慢代谢化合物（Timolol，Mephenytoin和Atorvastatin）得到准确的清除率数值；2个慢代谢化合物（Zolmitriptan和Theophylline）因其更低的清除率无法得到准确的清除率数值。

表2. 慢代谢化合物的肝固有清除率数据

• 化合物在肝细胞中的对数剩余率-时间曲线图如下。

图4. 化合物在肝细胞中的对数剩余率-时间曲线图

对于慢代谢化合物，贴壁肝细胞孵育方法可以计算出准确的清除率数据，但由于其酶活的局限性，其最长孵育时间为48小时，针对一些代谢更慢即具有更低的清除率的化合物，不能获得其准确的清除率数据。

三、悬浮肝细胞relay方法^[3]

01 实验原理和方案

悬浮肝细胞的酶活可维持4小时，在该模型中4小时孵育结束时，将孵育混合物离心，随后移取上清并冷冻直至下一次孵育。第二次孵育开始时将该上清解冻，并加入新鲜复苏的冷冻肝细胞悬液继续孵育。该技术允许在长达20小时的时间内评估慢代谢化合物（5天，4小时孵育/天），并且由于每4小时使用新复苏的肝细胞悬液，因此细胞在整个实验过程中具有代谢能力。

图5. 悬浮肝细胞relay方法的转移流程

将冻存悬浮肝细胞使用预热的细胞复苏液复苏后，采用台盼蓝染色法确定细胞数量和细胞活率。接着将稀释好的肝细胞悬液铺于每个时间点的细胞培养板中，加入稀释好的化合物工作液，继续进行孵育。

02 验证数据展示

• 清除率数据

5个慢代谢化合物均得到准确的清除率数值，Timolol，Zolmitriptan和Theophylline清除率数据平均值和文献匹配（相差在1.5倍之内）。

表3. 慢代谢化合物肝固有清除率数据

• 化合物在肝细胞中的对数剩余率-时间曲线图如下。

图6. 化合物在肝细胞中的对数剩余率-时间曲线图

通过该悬浮肝细胞relay 方法，5个慢代谢化合物均可以得到准确的清除率数据。同时悬浮肝细胞种属可灵活选择。

通过5个慢代谢化合物代谢清除率数据，对比贴壁肝细胞孵育体系和悬浮肝细胞relay方法，可以看出慢代谢化合物在贴壁肝细胞的代谢会慢于悬浮肝细胞，主要分析原因如下：（1）悬浮肝细胞和贴壁肝细胞相比，其外排转运体表达不完整；（2）悬浮肝细胞孵育过程中转速较高，化合物和细胞的接触面积增加，化合物可更快的进入细胞中。

四、慢代谢研究模型的实际应用

如果一个化合物在开展肝微粒体和悬浮肝细胞代谢稳定性实验时无法观察到其明显的代谢，最长孵育时间点的剩余率接近100%，那么如果想计算出该类化合物准确的清除率数值，可采用本篇文章中介绍的2种代谢模型，即贴壁肝细胞实验方法和悬浮肝细胞relay 方法。我们可根据这两种方法的特点来选择合适的模型：

1. 评估转运体对代谢的影响，可优先选择贴壁肝细胞孵育方法，因为贴壁细胞模型转运体表达相对完整；

2. 评估不同种属之间的代谢差异，可优先选择悬浮肝细胞relay方法，因为悬浮肝细胞种属齐全。

图7. 慢代谢研究模型的应用

结语

通过应用药明康德药性评价部已经建立的2种体外研究模型，可获得更加准确的慢代谢化合物体外代谢清除率数值，进一步来预测体内清除率，为临床给药剂量和给药频次提供指导。我们会继续探索其他慢代谢化合物研究方法，例如Co-culture或其他模型。尽管近年来体外代谢研究方法和技术取得了相当大的进展，但还需要更多的研究来改进应用体外数据对体内情况的推断的准确性。我们会继续专注于体外代谢方法研究，探索更多的模型以更好的助力药物研发。

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作者：刘海娟，王翔凌，陈根富

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹