肝穿刺活检术在新药研发大动物PK中的应用

肝脏是人体重要的代谢和解毒器官，参与机体糖、脂肪、维生素、激素和药物等的代谢活动，同时具有分泌和排泄胆汁与制造凝血因子等功能。

近年来，肝脏疾病日益增多，药物市场需求也大幅增加。伴随新分子实体药物的快速发展，尤其寡核苷酸类药物肝靶向的特点，直接研究药物在肝脏的暴露可以更好的评估该类药物的量效关系。在动物实验中，肝穿刺活检术是一种经济有效的肝脏组织分布评估方法，但操作技术要求较高。本文通过大动物实验中肝穿刺的挑战和经验，案例分享和优势，总结与展望等方面对该技术进行详细介绍。

一、肺穿刺活检术介绍

研究药物在肝脏的暴露量，传统的方法是通过动物解剖获取肝脏组织进行浓度分析。这一方法常在啮齿动物中研究药物在肝脏组织的分布；如果进一步评估药物在大动物(犬，猴等)肝脏组织中的暴露量，解剖获取的方法显然是不经济也不合适的。因此在大动物实验中，常采用肝穿刺活检术进行肝脏分布研究。肝穿刺活检术（以下简称肝穿；图1）是在麻醉状态下利用活检枪穿刺肝脏后切取少量肝组织的一种操作技术。肝穿刺活检术可允许在大动物体内进行多次活检，研究药物在肝组织中的暴露情况。

图1. 肝穿刺操作示意图

二、肺穿刺技术的挑战与经验

肝穿在临床上应用比较广泛，但依然可能出现并发症，如感染，腹腔出血，肝内及被膜下血肿等。在临床前实验中，在进行实验动物穿刺操作时也充满着挑战，对于操作人员和动物的选择等方面有着严格的要求。

操作人员要求：

操作人员经验丰富，熟知动物解剖结构以及B超呈像原理；良好的无菌操作意识；根据麻醉时间合理选择麻醉药；根据不同实验方案需求选择合适穿刺枪；多次操作情况下能够根据动物状态评估动物恢复情况等。

动物要求：

无凝血功能障碍、贫血、腹腔积液等症状；为方便肝穿操作，尽量挑选体重大的动物。

保证动物福利是我们实验操作的前提条件：包括动物的健康评估、注射麻药、止血止疼药物等减轻动物的疼痛反应，监测动物生理指标进行保温和给予额外辅食等操作。

经过多年来技术精进和经验的积累，药明康德药性评价部大动物PK团队归纳并总结出一套安全有效、切实可行的操作方案，在保证动物健康的情况下，高质量完成多次连续的肝穿操作，多次受到合作伙伴的肯定和表扬。

常规的肝穿操作流程包括以下几个方面：

• 实验前的准备：

动物的剃毛消毒以及相关的检测工作；药品器械的准备等（图2、图3）；

• B超定位：

定位切面时避开胆囊和大的血管规避肝穿风险；

• 穿刺操作：

操作人员之间密切配合，保证整个穿刺操作过程在B超引导下能够清晰的看到进针路径（图4）；

• 样品收集：

确认组织样品是否正确（去除多余的脂肪、结缔组织等），即时冻存处理；

• 术后护理：

做好术后止血及其术后三天动物饮食、精神、活动性的观察等，对于动物后续出现出血、感染以及腹腔积液等情况做出正确的判断及处理。

图2. 相关器械药品

图3. 穿刺枪

图4. 肝穿B超页面

三、肺穿的案例分享及经验

案例一

某乙肝药物的临床前药物代谢动力学研究中，为评估药物在肝脏中的浓度水平，将大鼠口服给药实验设计为四组、每组3只，共12只动物，以满足检测系列时间点血浆浓度，和第1、2和8小时的肝脏药物浓度的实验目的。若以同样的实验设计开展犬实验，将牺牲大量实验动物，大幅度增加研究成本；因此，在犬实验中采用肝穿刺技术，只需3只犬（如表1），即可获得与小动物实验相同的药代动力学研究样本，并且实验中的肝脏样本来自同一只动物（如图5），降低了个体差异的风险，节约了大量动物资源。

表1. 大鼠及犬肝脏分布实验样品收集

（备注：P表示采集血浆样品，L表述采集或肝穿刺获取肝脏样品，

R#：大鼠动物编号，D#：犬动物编号。）

图5. 比格犬单次灌胃给予TA1后的个体肝脏药物浓度

案例二 肝穿在寡核苷酸药物研发中的应用

对于寡核苷酸类药物，递送技术比较成熟的两种递送系统分别为：GalNAc与ASGPR结合进入肝细胞；纳米脂质体与ApoE结合，经肝细胞LDL-R进入肝细胞。两者均实现寡核苷酸药物在肝脏的靶向作用。寡核苷酸药物进入体内后快速分布至肝脏组织，在血浆中浓度快速下降，血浆半衰期较短，而在肝脏组织中浓度较高且持续较长时间。

图6、图7为食蟹猴单次皮下注释给予GalNAc修饰的siRNA药物后，血浆和肝脏的药物浓度图。其血浆中浓度在给药后16小时降低到最低检测限以下，而肝脏中的药物浓度直到给药后57天仍然呈现较高的浓度水平。

图6. 食蟹猴单次皮下注射给予TA2后平均血浆药物浓度时间曲线

图7. 食蟹猴单次皮下注射给予TA2后平均肝脏药物浓度

结合以上案例，总结肝穿的优势主要有以下两点：

1. 符合动物伦理3R（减少、替代、优化）要求。

2. 实现同一动物上多次采集样品，保证了数据的平行性。

结语

肝穿不仅在临床上具有广泛的应用，同时在新药研发过程中也扮演重要角色。目前，肝穿在新药研发中已广泛用于疾病模型的动态监测、组织药物浓度分布情况的测定、目标基因的测定等。

药明康德药性评价部大动物PK团队拥有超过10年的肝穿经验，精益求精，持续不断地打磨技术方法，更新仪器设备，积累经验，组建出一支技术精湛的专业团队，致力于不断服务于更多的客户，助力新药研究。

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。 

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作者：李华玉，赵航，李杰，杨光，刘守桃，金晶

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟