药物与黑色素结合的体外研究方法及意义

黑色素分布在人体多个部位，包括眼睛，皮肤等组织。药物与黑色素的结合可使药物在组织中保留，影响眼部用药的分布和消除^[1]，引起其在眼内的药动学和药效学改变，干扰正常的视网膜功能。此外，高黑色素结合药物在组织中长期积累也会带来药物不良反应，如增加眼部光毒性和内耳毒性。根据2015年ICH《S10 Photosafety Evaluation of Pharmaceuticals Guidance for Industry》的建议，应评估药物体外与黑色素的结合潜力。本文将介绍药物与黑色素结合的体外研究方法，并探讨研究药物与黑色素结合的意义及影响，为新药开发提供参考。

一、黑色素的定义及功能

黑色素是在黑色素小体（细胞内被脂质膜覆盖的一种细胞器）内合成的，是一种阴离子型聚合物，由酪氨酸通过酶促反应和自发反应衍生而来（如图1）^[2]，广泛存在于眼睛、皮肤、头发、大脑和内耳中。黑色素包括真黑色素和褐黑色素两种类型，两者具有不同的颜色和分子结构。黑色素具有显著的活性氧清除能力，并可通过金属离子螯合能力减少活性氧的生成。这些特性在保护色素细胞免受天然毒素等方面具有重要意义^[3]。

图1. 黑色素的合成路线^[2]

二、药物与黑色素结合产生的影响

目前已报道的与黑色素结合的药物多为小分子药物，虽然蛋白质和寡核苷酸的黑色素结合也有报道，但由于大分子穿过质膜和黑色素小体膜的渗透性较差，预计大分子在体内很难到达黑色素所在部位。与体内研究黑色素结合的方法相比，体外黑色素结合方法具有以下两点优点：

• 体外研究成本低，操作简单；

• 体外黑色素结合可为体内临床前研究提供重要参考。

药理学影响

黑色素结合是眼药动学和药效学的重要影响因素，药物与黑色素结合可延长药物在眼部的保留，使药物的半衰期延长，同时黑色素结合部分药物缓慢释放，释放后游离药物能够到达靶点，进一步增强药效（如图2）。因此在药物开发中需要考虑黑色素结合，以评价黑色素在眼部药物保留中的作用。

图2. 药物与眼黑色素结合产生药理学影响的原理

药物半衰期延长

早在20世纪70年代，部分眼部药物在有色和白化动物中存在药理作用的差异已被研究。研究发现，在体内有色动物中，药物一旦与黑色素结合就会形成一个小的药物存储库，缓慢释放到组织中，进而影响药物的药代动力学、有效性和安全性。如阿托品^[2]，经研究发现其在有色动物中的保留时间和药物作用时间长于白化动物（有色动物和白化动物的半衰期分别为96h和43h），药物在黑色素组织中的蓄积除了可使药效延长，也可能导致潜在的毒性，因此药物与黑色素结合的研究需引起重视。

药物靶向性提高

在眼底疾病治疗药物的递送系统中应用药物-黑色素结合的特点，对化合物加以修饰，增加化合物的碱性和亲脂性，可使化合物与黑色素的结合能力增强，提高眼底疾病治疗药物的靶向性。如抗血管内皮生长因子（Vegf）药物帕唑帕尼^[4]，单次口服帕唑帕尼导致葡萄膜中形成药物储库，在脉络膜新生血管模型中缓慢释放足以抑制血管生成。这些发现表明，黑色素结合改变了药物药理作用的程度和过程，是治疗脉络膜新生血管（CNV）病变的一种有前景的靶向方法。

药物与黑色素结合的潜在不良反应

由于药物与黑色素结合，与无色素组织相比，有色眼细胞中的黑色素小体可作为储存器蓄积药物。重要的是，相当一部分药物包括系统给药的非眼部药物（如氯喹、氯丙嗪等），也可能在黑色素组织中长期积累可引起不良反应，例如干扰视网膜功能，在视觉上产生不可预见的后果，也可能产生光毒性和内耳毒性，所以药物与黑色素结合的研究应引起高度重视。

眼部光毒性

某些药物（如司帕沙星）可作为光敏剂，在眼睛中诱导光毒性作用^[5]。当药物吸收太阳光时，通过诱导细胞中活性氧的生成和氧化应激，发生光毒性反应，引起细胞损伤^[5,6]。一些黑色素结合药物，如喹诺酮类抗生素^[7,8] 和氯丙嗪^[9] 具有光毒性。例如分别给药司帕沙星和氧氟沙星后，在小鼠和兔视网膜色素上皮中观察到明显的细胞损伤^[7,10]。Shimoda和Kato^[11]发现，喹诺酮类药物处理后的紫外线暴露在白化动物视网膜中引起光毒性反应。

内耳毒性

氨基糖苷类抗生素作为抑菌药物被广泛使用，但可能导致严重的肾毒性和耳毒性。据报道氨基糖苷类抗生素作用于有色豚鼠的内耳毒性明显大于白化豚鼠，表明其耳毒性可能与黑色素关系密切^[12]。这种现象可能导致抗生素在内耳色素组织中蓄积，并促进对周围细胞的毒性作用。

小结

药物在眼组织中的长期积累会引起很多不良反应，因此我们需要开发药物与体外黑色素结合的研究方法，与体内实验相互佐证以阐明药物与黑色素结合的具体机制，从而减轻药物在眼或其他组织中长期积聚产生的毒性。

三、药物与体外黑色素结合的研究方法

目前已报道的体外黑色素结合方法有平衡透析法、快速平衡透析法和离心法，药明康德DMPK团队选取平衡透析法和离心法进行了验证，建立了体外评估药物与黑色素结合的研究方法。体外黑色素有不同来源^[2]（如表1），最常见的天然黑色素是从牛眼、猪眼及墨鱼的墨汁中提取而来。

表1. 不同来源的黑色素^[2]

01 平衡透析法

采用平衡透析法测定化合物与体外黑色素的结合率。其方法与血浆平衡透析法相似，通过孵育一定时间，经平衡透析的方式将结合药物与游离药物分离（步骤见图3），计算化合物与黑色素的游离率，结合率和回收率，判断化合物在黑色素中的分布。

实验室选择了已上市的9个商品药物阿替洛尔（atenolol），氯喹（chloroquine），普萘洛尔（propranolol），双氯芬酸（diclofenac），纳多洛尔（nadolol），奎尼丁（quinidine），氟康唑（fluconazole），噻吗洛尔（timolol maleate），氯丙嗪（chlorpromazine）作为测试化合物，采用平衡透析法评估化合物与黑色素结合的实验验证，得到药物在墨鱼黑色素中的结合率（bound%），实验结果与文献值对比相关性良好，拟合优度R²值大于0.9（图4）。

图3. 平衡透析法操作步骤

图4. 平衡透析法测定药物在黑色素中的结合率（In house %Bound）与文献值（Literature %Bound）的相关性

02 离心法

采用离心法测定化合物与体外黑色素的结合率。其方法为在一定的转速、时间等条件下，通过离心的方式将结合药物与游离药物分离（步骤见图5），使用LC-MS/MS法检测化合物的F（游离样品），T（总样品）和T0（零时刻的样品），计算化合物与黑色素的游离率，结合率和回收率，判断化合物在黑色素中的分布。

为验证方法的可行性，实验室同样选择了上述9个商业化标准品，采用离心法评估化合物与黑色素结合的实验验证，得到墨鱼黑色素中的结合率（Bound%），实验结果与文献值对比相关性良好，拟合优度R²值大于0.9（图6）。

图5. 离心法操作步骤

图6. 离心法测定药物在黑色素中的结合率（In house %Bound）与文献值（Literature %Bound）的相关性

四、黑色素体外结合模型在新药研发中的综合应用

尽管已有许多例子显示黑色素结合的生物相关性，但其从体外至体内的药代动力学转化仍未完全阐明^[13]。研究表明，当用体外分离的黑色素测定时，碱性、亲脂性和芳香族分子与黑色素的结合程度最高。虽然黑色素结合也可用Kd（解离常数）值定量判断化合物的结合程度，但由于Kd（解离常数）值需不同浓度、不同时间点进行定量检测，误差大、成本高，一般而言，在我们的体外试验中测定药物与黑色素结合的fu（游离分数）值，实验结果误差小，成本低，可为体内临床前研究提供参考。因此，基于该体外研究模型，并通过在机制水平上理解药物-黑色素结合与体内代谢过程的相互作用可能有助于利用体外试验数据来预测药物与体内黑色素的结合能力，为合理设计具有理想理化性质和ADME特征的新候选药物提供指导。

结语与展望

药明康德药性评价部（DMPK）团队已经建立了高通量的黑色素体外结合研究模型，该方法具有速度快，效率高，平均成本降低等优势。利用该模型，我们可更精确地解读局部眼科药物及全身药物在黑色素中的蓄积与分布，为后续药代动力学和药理学效应提供参考。

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。 

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作者：陆春红，汤雪，王洁，王翔凌，陈根富

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹