快速检测亲脂性：反相液相色谱法的建立和应用

亲脂性又称脂溶性（Lipophilicity）是化合物在非极性溶剂中的溶解能力，通常通过化合物在液-液或液-固两相系统的分配行为来测定其亲脂性。药物的亲脂性在药理学，药代动力学和毒理学中都具有非常的重要作用^[1,2]，因此，研究受试化合物的亲脂性有助于建立药物构效关系。化合物ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）性质的研究对于其成药性至关重要，预测受试化合物亲脂性有助于化合物ADMET性质的研究，帮助科研人员在早期发现其成药性的问题，可以降低临床研究阶段候选药物的淘汰率。药物筛选早期化合物检测量非常大，因此，药物研发人员迫切希望找到快速准确地测定药物亲脂性的方法，助力药物筛选研究。

本篇文章主要总结了药明康德DMPK化合物亲脂性的检测方法，并详细介绍了现今针对高亲脂性化合物的检测方法：反相液相色谱法以及其与经典摇瓶法的不同适用场景，以期加速药物研发。

一、Log P表征亲脂性

19世纪末20世纪初Meyer和Overton第一次用分配系数来解释有效物质的生物学活性效能^[3]，到1964年后，Hansch的辛醇-水系统描述了摇瓶测定方法作为实验及理论上的研究标准^[4]。化合物的亲脂性被公认为定量构效关系（QSAR）研究中一种极为重要的参数之一，而Log P和Log D是测定亲脂性的两种表征参数。Log P是指在某一特定pH下，化合物在两相中全部以分子形式存在，测得化合物在有机相和水相中分配系数的对数。Log D是指在某一pH环境下，化合物以分子和离子形态在有机相和水相中分配系数的对数^[5]。一般来说，Log P及Log DpHx的值越大表示化合物亲脂性越强。Log P 的大小只与化合物基本属性如分子体积、偶极矩、氢键酸碱度有关，而Log D除了与化合物的这些基本属性相关外还与其所处环境的pH有关，Log P的大小能更直接反映化合物亲脂性的总体趋势，本文将重点介绍Log P 的检测方法。

二、Log P的检测方法

目前检测Log P的方法主要有：计算机模拟法、摇瓶法和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)等。对三种检测方法进行比较（表1），计算机模拟方法比起实验方法更经济且快速，但它的预测性需依靠所选软件是否将化合物所有亚结构的贡献值全部算进去，所以预测值相对实验检测值准确性会差一些；摇瓶法作为一种直接检测Log P的实验方法，是亲脂性检测方法的金标准，这种方法具有实验结果准确和样品用量少的优点，但摇瓶法有一定的局限性，比如它相对耗时，需要纯度较高的化合物，不适用于不稳定的化合物和检测范围通常为 -2<Log P<4。随着药物研发的管线的日益增多，现阶段高脂溶性的化合物比例日益增多^[6]（图1），对于高亲脂性（Log P＞5）的化合物，其在水相中的溶解度极低，很难通过检测仪器获得精准的数值，而是用一个区间范围来表示。与摇瓶法相比，反相液相色谱法具有速度较快，较温和，化合物需求量少且纯度要求较低，检测范围也更广（在一些特殊情况下也可以扩展到Log P＞6的化合物亲脂性的检测）等优点，所以反相液相色谱法被广泛关注和应用。

表1. 不同 Log P检测方法对比  ★表示程度大小

图1. 1939-2020年间，获批化合物ALog P的变化趋势

经济合作与发展组织化学品测试导则(OECD 2004年)《分配系数（正辛醇-水）：高效液相色谱法》也指明了高效液相色谱法检测Log P适用范围与要求^[7]，阐述了反相高效液相色谱法对高亲脂性化合物Log P检测上有明显的优势。相关文献^[8]也报道了此方法也适用于高亲脂性的新分子实体如PROTAC类化合物的亲脂性检测。

三、如何建立反想液相色谱法（RP-HRLC）检测亲脂性的方法

RP-HPLC 方法检测化合物Log P的基本步骤:

1. 将选取的参照化合物打入色谱系统，获得参照化合物的保留时间，计算其容量因子。

2. 用容量因子的对数与参照化合物已知Log P做线性回归方程，此方程称作标准方程。

3. 根据待测化合物在相同的色谱条件下获得的保留时间，计算得到的容量因子，带入标准方程，得到待测化合物的Log P。

此过程最重要的是标准方程的建立。

四、反想液相色谱法检测亲脂性方法一

根据上述步骤，基于OECD的要求，建立了反相液相色谱方法一检测亲脂性（下文简称方法一）。在参照化合物的选择上，选择了覆盖低亲脂性到高亲脂性的6个化合物（表2）。确定参照化合物后，接下来优化色谱参数方法包括流动相，梯度，色谱柱等，最终确定合适的色谱参数。以log k为横坐标，Log P为纵坐标，绘制标准方程（1），获得的方程线性相关性R²为0.97（图2），符合法规要求。参照化合物中Log P值最大的化合物三苯胺保留时间为27.1分钟，故采用此方法可以检测Log P值在6以内的化合物，并基本在30分钟内完成检测。在药物早期筛选阶段，方法一的高效率非常有利，此阶段研究人员需要在短期内检测大量的化合物，并快速获得化合物的性质参数，对被筛选的系列化合物进行排名，进而作出进一步的研究决定。

• Log P =a*log k+ b (1)

表2. 参照化合物列表

图2. 方法一标准方程线性拟合

五、反相液相色谱法检测亲脂性方法二

随着药物研发的不断推进，到了研发后期，需要更加准确的Log P数值来指导后续实验设计，此时对Log P的准确性有更高的要求，因此，药明康德 DMPK团队在方法一的基础上优化建立了第二种方法。

研究表明^[9]，反相液相色谱法检测亲脂性的方法在流动相的选择上，一般选用水或者缓冲液，添加一些修饰剂，比如甲醇、乙腈或四氢呋喃。其中甲醇不会影响水中氢键的形成，且可与色谱柱固定相相互作用形成单层膜，这能提供与正辛醇相类似的氢键作用力，因此，甲醇也成为最优修饰剂。需要注意的是，有机修饰剂会影响离子型化合物的pKa，干扰保留时间，继而影响测得Log P值的准确性。为了消除此影响，使用与方法一相同的参照化合物，建立反相液相色谱法检测亲脂性方法二（下文简称方法二）。方法二使用log k_w （没有有机修饰剂时化合物容量因子）代替公式（1）中的log k，标准曲线方程如公式（2）。对于每一个参照化合物，可通过3个流动梯度条件下，建立log k和甲醇含量φ的方程，即公式（3），公式（3）的截距即为log k_w。图3显示方程（2）R²为0.996，预测性较方法一更好。在药物研发后期，方法二可提供一个更准确的化合物亲脂性的检测结果。

• Log P =a*log k_w+ b (2)

• log k= Sφ+ log k_w (3) 

图3. 方法二标准方程线性拟合

六、两种反相液相色谱法（方法一和方法二）数据验证与对比

我们选择亲脂性从低到高的21个化合物，测得其Log P值(表3)，数据显示85%的化合物在使用方法一测定时，可获得与文献^[7,10]报道一致的数值，差值在0.5log内。对于差值超出0.5log 的3个化合物使用方法二重新检测，方法二获得的结果与文献值一致。可见，方法一和方法二适用于亲脂性化合物的检测，且方法二有更高的准确性。

表3. RP-HPLC检测21个化合物Log P的结果

相比于的摇瓶法，建立的两种检测化合物Log P的反相液相色谱法方法（方法一和方法二）各有优势。方法一快速而经济，方法二预测性更好（表4）。

表4. 方法一、方法二和摇瓶法在应用上的对比

结语

亲脂性作为化合物重要的理化性质之一，在药物早期筛选就开始被研究，以期获得一个合适的Log P，提高药物研发的成功率。目前，检测Log P的经典方法摇瓶法受限于化合物溶解度和仪器检测，在高亲脂性化合物的检测上有一定局限性。反相液相色谱法检测Log P的方法，可实现高通量快速检测，并可检测高亲脂性高的化合物的Log P，可以解决摇瓶法的局限性。将已建立的两种反相液相色谱法（方法一和方法二）与摇瓶法相结合，可根据客户需求，在不同药物研发阶段提供更为准确、高效的化合物Log P 检测方法。例如，在药物前期筛选阶段，化合物数量多，时间紧促，可以选择方法一，快速检测获得化合物Log P值，帮助研究人员快速决策；在药物研发后期，可根据项目需求不同，选择方法二或者摇瓶法检测Log P。药明康德DMPK已成功搭建了反相液相色谱法检测Log P的技术能力和平台，已完成数百个化合物的Log P的检测，赋能药物早期筛选。

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。  

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作者：成立炜，郑丽襟，冯全利，汤城

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟