多数药物在体内主要以代谢的形式清除，介导体内药物代谢的酶以CYP450酶为主，因而检测化合物对CYP450酶的作用就显得尤为重要。其中，一些药物对CYP450酶活性呈现一定的抑制作用，抑制自身或其他药物代谢。当它们与其他药物合用时，可能因为药物代谢酶被抑制从而引发严重的药物相互作用。根据抑制的机制不同，药物对于CYP450酶的抑制作用可分为可逆性抑制（Reversible Inhibition）和不可逆性抑制（Irreversible Inhibition）（图1）。时间依赖性抑制（Time-dependent Inhibition, TDI）造成的酶失活是不可逆的，停药后仍然会有一段时间的抑制，对人体可能造成更大的影响，因此逐年受到监管机构及药物研发者的重视。美国PhRMA、FDA、欧洲EMA和中国NMPA均先后发布了工业白皮书或指导原则，明确表示在标准的体外实验中应进行药物对常规7个CYP450酶的TDI研究。
本文将介绍一种体外评估时间依赖性抑制的新研究方法，即Area Under the Curve (AUC) Shift法，可以解决常规方法（IC50 shift法）无法获取IC50偏移倍数（IC50 shift fold）的问题，希望可以帮助药物研发者获得更准确的数据，推动药物研发进程。本文主要从以下四个方面来介绍TDI AUC shift方法建立的全过程。
TDI常规评估方法IC50 shift法及其限制
如何建立AUC shift方法
AUC shift方法建立的结果展示
AUC shift方法的应用场景
图1. 药物对CYP450酶的抑制作用
一、TDI常规评估方法IC50 shift法及其限制
目前使用比较广泛的判断TDI效应的方法为IC50 shift法，即通过测定化合物在预孵育过程中在加和不加NADPH情况下，对细胞色素P450酶的IC50 shift fold并采用IC50 shift fold ≥1.50来判断化合物是否具有时间依赖性抑制作用（即机制性抑制作用）。然而在实际应用过程中会发现在不少情况下，IC50 shift fold 无法获取，从而无法对化合物的TDI效应做出准确判断。
药明康德测试事业部药性评价部体外团队在多年的经验中总结了如下3种经典场景，均无法获取IC50 shift fold 而难以准确判断化合物是否具有TDI效应。三种场景分别举例如下：
01 测试化合物的IC50 shift fold为范围值（> [0-1.50) ，图2a）；
02 化合物溶解度受限（原定最高测试浓度为50.0 μM），难以获取测试化合物的IC50值（图2b）；
03 化合物为弱机制性抑制剂，在测试条件下，难以获取IC50值（图2c）。
图2. 三种无法获取准确IC50 shift fold的场景举例
测定化合物的TDI效应在药物研发过程中的重要性与日俱增，因而若不能对化合物的TDI效应做一个准确的判断将是药物发现中的重要问题。例如：药化专家不能对其所开发的化合物的TDI效应进行排名或比较，在下一步决策上会缺乏判断依据。因此，在药物研发过程中需用引入一种新的且可量化的方法进行化合物的TDI判断，通过文献查阅，AUC shift方法走入我们的视线。即通过测定化合物在预孵育过程中在加和不加NADPH情况下，对细胞色素P450酶抑制的曲线下面积的偏移（AUC shift）来判断化合物是否具有时间依赖性抑制作用，从而完善体外CYP TDI研究，并为进一步预测临床DDI风险提供依据。
二、如何建立AUC shift方法
无论是IC50 shift还是AUC shift方法，其实验设计均相同，即测试化合物的实验条件和过程是一致的，唯有后续数据处理方式不同。因而建立AUC shift方法的关键是确定其判断化合物具有TDI效应的临界值。因此，本方法建立分为两步走。
第一步：调研文献，选择7个CYP450酶亚型各自的强、中、弱和无TDI抑制剂共27个商业化标准品，并采用IC50 shift方法的实验设计进行实验；
第二步：将所选商品化化合物的实验数据分别进行IC50 shift fold及AUC shift值计算，根据化合物是否具有TDI效应及对应的计算值确认AUC shift方法的临界值，以IC50 shift fold值佐证建立稳定、可靠、可重复的AUC shift平台。
三、AUC shift方法建立的结果展示
我们采用新方法（AUC shift）测定了27个商业化标准品（强、中、弱 和无TDI抑制剂）对人肝微粒体细胞色素P450酶（CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A）的时间依赖性抑制作用，且与文献报道值进行了比较。依据化合物是否具有TDI效应及计算得到的AUC shift值，我们最终采用AUC shift 值15.0%作为临界值。
下面以CYP3A（以咪达唑仑（midazolam）为底物）、CYP2C9和CYP2C19分别为例展示实验结果。
例1
酮康唑（ketoconazole）和竹桃霉素（troleandomycin）分别为FDA和NMPA推荐的用于判断CYP3A的可逆性和时间依赖性抑制的阳性对照，即分别为无TDI和强TDI的抑制剂，我们所测其IC50 shift fold和AUC shift (%)均接近于文献报道值，其结果也与FDA和NMPA推荐一致。
备注：蓝色点和蓝色线分别代表WuXi AppTec检测平均值和标准偏差（n=3），橙色点和橙色线分别代表文献平均值和标准偏差（n=10）
例2
磺胺苯吡唑（Sulfaphenazole）和替宁酸（Tienilic Acid）分别为FDA和NMPA推荐的用于判断CYP2C9的可逆性和时间依赖性抑制的阳性对照，即分别为无TDI和强TDI的抑制剂，我们所测其IC50 shift fold和AUC shift (%)均接近于文献报道值，其结果也与FDA和NMPA推荐一致。
备注：蓝色点和蓝色线分别代表WuXi AppTec检测平均值和标准偏差（n=3），橙色点和橙色线分别代表文献平均值和标准偏差（n=10）
例3
(S)-(+)-N-3-苄基苯乙基内酰脲（ (S)-(+)-N-3-Benzylnirvanol）和噻氯匹啶（Ticlopidine）分别为FDA和NMPA推荐的用于判断CYP2C19的可逆性和时间依赖性抑制的阳性对照，即分别为无TDI和强TDI的抑制剂，我们所测其IC50 shift fold和AUC shift (%)均接近于文献报道值，其结果也与FDA和NMPA推荐一致。
备注：蓝色点和蓝色线分别代表WuXi AppTec检测平均值和标准偏差（n=3），橙色点和橙色线分别代表文献平均值和标准偏差（n=10）
根据文献中通用的两倍判断范围为标准，我们所测标准品的检测值接近于文献报道值。与此同时，我们也将如上抑制剂的数据进行了IC50 shift fold计算并与AUC shift（%）进行了对比，两种方法所得结果完全一致。由此可知我们建立了体外研究CYP TDI的新方法：AUC shift。
四、AUC shift方法的应用场景
例1
对于化合物A，传统IC50 shift方法可得IC50 shift fold>1.33，无法肯定判断化合物是否具有TDI效应，而用AUC shift方法即可获取具体的数值，并肯定判断化合物TDI效应的情况（图3）。
图3. 使用AUC shift法评估IC50 shift fold为范围值的化合物
例2
对于化合物 B，因溶解度受限（原定最高测试浓度为100 μM）而难以获取IC50值，因此传统IC50 shift方法无法计算IC50 shift fold，从而难以判断化合物是否具有TDI效应，而用AUC shift方法可获取具体的数值，并肯定判断化合物TDI效应的情况（图4），这与化合物的实际情况（+NADPH组最高测试浓度下较低的活性百分比；-NADPH和+NADPH组两条曲线偏离较远）相吻合。
图4. 使用AUC shift法评估溶解度受限的化合物
例3
对于化合物C（弱TDI），在较高测试浓度下，传统IC50 shift方法无法计算IC50 shift fold，从而难以判断化合物是否具有TDI效应，而用AUC shift方法可获取具体的数值，并肯定判断化合物TDI效应的情况（图5），这与化合物的实际情况（+NADPH组最高测试浓度下较低的活性百分比；-NADPH和+NADPH组两条曲线偏离较远）相吻合。
图5. 使用AUC shift法评估弱TDI化合物
以上3个案例表明：AUC shift方法的加入可解决IC50 shift方法难以解决的问题，从而更为准确的判断待测化合物是否具有TDI效应，为受试药物临床实验设计提供依据。
结语
本文主要介绍了药明康德DMPK成功搭建的体外评估TDI的新方法：AUC shift。结合药明康德DMPK在前期积累的丰富经验，伴随着新工具的加入，我们将结合IC50 shift和AUC shift两种方法，判定化合物TDI效应，为先导化合物的结构优化、候选化合物的临床实验设计提供重要的依据。建立完善的决策树机制，完善TDI研究，从而为进一步预测临床DDI风险提供依据。
药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。
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作者：李建兰，姜利芳，陈根富
编辑：方健，钱卉娟
设计：倪德伟
参考
[1] Mukadam S, Tay S, Tran D, Wang L, Delarosa EM, Khojasteh SC, Halladay JS, and Kenny JR. Evaluation of time-dependent cytochrome P450 inhibition in a high-throughput, automated assay: introducing a novel area under the curve shift approach. Drug. Metab. Lett, 2012, 6 (1): 43-53.
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