寡核苷酸药物的代谢及代谢产物分析和鉴定研究

近年来，由于寡核苷酸独特的基因表达调控优势，其研发、生产和商业化得到了快速发展。经全球数据搜索，在1998年至2022年间有16个寡核苷酸药物获得上市批准，一百多项涉及上百个寡核苷酸的II期或III期临床试验正在进行中。这些寡核苷酸针对66种基因，在涵盖14个治疗领域的102个不同适应症中获批或试验^[1]。

和传统小分子药物一样，在药物临床前研究阶段，通常需要进行体外和动物体内的代谢研究，以帮助了解寡核苷酸药物是否有能力达到治疗目标，并提供代谢途径及其产物相关信息。目前所有已上市的寡核苷酸药物均在申报材料中提交了药物的体内、体外代谢研究报告，以阐明药物的代谢行为和清除途径。在本文中，我们主要介绍了寡核苷酸药物的作用机理、代谢酶和代谢行为、体内外代谢研究策略以及代谢产物分析和鉴定方法，为寡核苷酸新药开发提供参考。

一、寡核苷酸药物的简介

寡核苷酸，由人工合成小于100 nt (nucleotides)的修饰核糖核苷酸（RNA）或脱氧核糖核苷酸（DNA）单链或双链组成，主要通过Watson-Crick碱基配对原则作用于靶基因，可经过多种机制作用于基因表达。由于寡核苷酸通过与DNA或RNA进行Watson-Crick 碱基配对来执行其功能，理论上寡核苷酸可以靶向任何感兴趣的基因，只需选择目标DNA或RNA上正确的核苷酸序列，与靶序列高度互补，寡核苷酸药物应该比小分子药物更具特异性^[1]。

外源性寡核苷酸进入体内发挥作用，需要克服多种障碍，如结构不稳定易被体内的核酸酶降解；分子结构较大且带负电荷，穿透细胞膜难度大，很难渗透到细胞内发挥药效；从内吞体逃逸到细胞质中的逃逸效率低；具有免疫原性，激活人体免疫系统反应等。

随着技术发展，以上部分难题已经有较好的解决方法，化学修饰和递送系统技术的突破对寡核苷酸药物的发展起到了至关重要的作用。

1.1 寡核苷酸药物的化学结构修饰

通过对寡核苷酸进行化学修饰，可以增加其对核酸酶的稳定性和改善其靶标结合的亲和力。第一代化学修饰是对磷酸骨架的修饰，如硫代磷酸酯（PS）。第二代化学修饰是针对RNA的2’-O位和DNA的2’位的核糖进行修饰，其中2-O-甲基（2-OMe）、2-O-甲氧基-乙基（2-MOE）和2-氟（2-F）修饰是最常用的类型。第三代化学修饰为核糖和碱基上的修饰。常见的寡核苷酸化学结构修饰^[2][3]如下图1所示。

图1. 常见的寡核苷酸化学结构修饰^[2][3]

1.2 寡核苷酸药物的递送

寡核苷酸需要借助递送系统，以提高递送效率、减少给药剂量、提高耐受性，从而提高药物的安全性。发展自今，递送系统多种多样，目前应用较成功的递送系统是脂质纳米粒包裹（LNP）技术以及与特定配体结合实现靶向递送（例如GalNAc）^[4]。

1.3 寡核苷酸药物的作用机制

寡核苷酸药物类型包括反义寡核苷酸（ASO）、小干扰RNA（siRNA）、微小RNA (miRNA)、适配体(Aptamer)、anti-miRNA（antagomir）、miRNA minic（agomir）和未甲基化CpG的寡核苷酸等。各类寡核苷酸的作用机理和位点示意图如图2所示，根据其作用机制，寡核苷酸药物治疗可能引起蛋白表达下降、增加或恢复^[2]。

图2. 寡核苷酸的作用机理和位点^[2]

由于每种寡核苷酸的作用机制不同，它们在发病的不同阶段发挥抑制剂的作用。如图3所示，Decoy作用于表达过程的上游，靶向DNA编码转录因子；反义寡核苷酸（ASO）、siRNA和miRNA作用于靶mRNA水平；适配体直接抑制参与发病蛋白的活性。它们的共同点是通过干扰基因表达，起到抑制发病的作用^[5]。

图3. 寡核苷酸药物作用于病理基因表达的不同阶段及在疾病进展发病机制中的活性标准示意图^[5]

二、寡核苷酸药物的代谢研究及代谢产物分析和鉴定

2.1 寡核苷酸药物的代谢酶和代谢行为

寡核苷酸药物主要通过核酸外切酶或核酸内切酶代谢降解成小的核酸片段。对于第一代进行硫代磷酸酯骨架修饰的ASO，在血液中主要是由核酸外切酶从3’端进行切割，代谢成小核酸片段，在组织中主要是由核酸外切酶从两端由外向内切割，代谢成小核酸片段。第二代ASO，通常是在中间位置有硫代磷酸酯，两端为非硫代磷酸酯含2’-O修饰的gapmer结构，在组织中会被核酸内切酶从中间切断，进一步由外切酶再逐渐切割成小核酸片段。与GalNAc相连的siRNA的正义链和反义链代谢各有不同，反义链由外切酶切割代谢成小核酸片段，而正义链首先从连接的GalNAc和linker逐一代谢脱掉，然后才被外切酶代谢成小的核酸片段^[6]。

图4. ASO和GalNAc-siRNA代谢途径示意图^[6][7]

2.2 寡核苷酸药物的代谢研究策略及方法

纵观二十多年来已上市以及在研阶段寡核苷酸药物的代谢研究，代谢研究实验模型从最早期的仅体内实验靶组织和血、尿等，到近几年的体外细胞、微粒体、S9、血浆或血清孵育等和体内给药后的血、尿、粪及靶组织。可见科学家们仍然在不断探索，寻找更为科学合理且全面的代谢研究方法。经过大量实验研究发现，通过体外血浆或血清中孵育，可获得寡核苷酸在血中水解酶作用下的代谢稳定性情况；通过S9中孵育，可获得与体内靶组织相近的寡核苷酸代谢行为。同时，通过使用人体外模型（亚细胞组分，例如S9）进行的代谢物谱分析有助于开发临床体内代谢物的定性/定量分析方法^[3]。

2.2.1 寡核苷酸体外和体内代谢研究策略

不同种属的寡核苷酸体外代谢产物鉴定可以得到各种属间的体外代谢差异，与动物体内代谢数据相比较，可获得体外、体内代谢的相关性推测，从而寻找与人种属代谢行为较接近的动物种属。常用的寡核苷酸体外代谢模型有血浆和S9，例如肝靶向的寡核苷酸用肝S9进行代谢稳定性和代谢产物分析鉴定。临床前体内代谢研究主要通过对动物体内的血浆、尿液、粪便、靶向组织（肝或肾等）进行代谢产物分析鉴定和定量生物分析。

表1. 寡核苷酸的体外和体内代谢研究策略

药明康德DMPK代谢产物鉴定团队近几年一直在探索研究寡核苷酸类化合物的体外、体内代谢研究方法。在寡核苷酸代谢研究平台建立之初，充分考察了二十多年以来寡核苷酸药物的研究方法，并通过实验对这些方法进行验证，优化并确认了实验过程中的各项因素。

2.2.2 寡核苷酸代谢产物鉴定研究的分析方法

目前寡核苷酸生物分析方法主要有LC-UV、LC-MS、免疫捕获杂交MSD、ELISA、LC-FL（荧光检测）和qRT-PCR等，其中LC-UV，LC-MS和LC-FL均可用于代谢产物的分析， 高分辨质谱（HRMS）因其具有较高的分辨率、灵敏度、特异性和质量精确度等特性，可采用全扫描和多种方式的离子扫描对未知代谢产物进行定性或定量分析；HRMS与LC-UV联用在寡核苷酸及其代谢产物的分析检测上优势更突出。 药明康德DMPK在寡核苷酸代谢研究平台配备了专用的UPLC-UV-HRMS仪器进行相关分析检测。

参照文献实验条件进行验证，与文献结果^[8]对比，在我们高灵敏度的高分辨质谱和精良的分析技术条件下，除了检测并鉴定出文献报道的主要代谢产物外，还鉴定出更多的低含量代谢产物。

表2. 寡核苷酸代谢产物鉴定对比：药明康德DMPK vs 文献

寡核苷酸分析难点及解决方案

• 样品前处理

常规样品处理方法主要有蛋白质沉淀（PPT）、液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）。寡核苷酸药物因其结构特点，经化学修饰后有较高的蛋白结合率。PPT方法虽然操作简单，但回收率较低，且有明显的内源性基质干扰，因此不推荐使用这种方法；一般采用LLE、SPE、或LLE和SPE联合使用来获得较高回收率，降低基质干扰影响。

LLE方法：常用苯酚-氯仿-异戊醇（PCI）作为萃取剂，去除蛋白、磷脂等有机物。根据化合物性质，调节pH值，例如加入氨水等，以提高寡核苷酸在水相中的溶解性。

SPE方法：生物基质中提取寡核苷酸药物最广泛使用的方法。将样品加载到被充分活化之后的SPE柱或板后，用淋洗液将蛋白质等干扰物质洗脱，随后用洗脱液将寡核苷酸相关组分洗脱下来，用于LC-MS分析（图5）^[9]。

另外，寡核苷酸在聚丙烯管/板和玻璃容器中均存在非特异性吸附，因此样品处理过程中应选择合适的耗材，例如低吸附的枪头、离心管和样品板等，减少因耗材吸附导致实验结果不准确。

• LC-MS分析

寡核苷酸属于强极性化合物，常规反相色谱方法很难获得保留和较好的峰形，通常使用离子对反相色谱（IP-RPLC）、亲水作用色谱（HILIC）和离子交换色谱（IEC）。其中离子对反相色谱是最常用的方法，主要使用三乙胺（TEA）、N，N-二异丙基乙胺（DIPEA）、乙酸三乙胺（TEAA）等胺类和六氟异丙醇（HFIP）组成离子对试剂。

图5. 寡核苷酸生物分析或代谢产物分析鉴定实验操作流程示意图^[9][10]

LC-MS数据分析及代谢产物鉴定

通过HRMS全扫描和二级扫描（Full MS/ddMS2）后，可以获得寡核苷酸及其代谢产物和其它杂质的相关信息。寡核苷酸的代谢产物分析鉴定、化学修饰位点以及序列确认等研究都需要专业的软件进行辅助识别、分析，如BioPharma Finder和ProMass。以下案例（图6和图7）是使用BioPharma Finder对ASO及其代谢产物3’ n-1的HRMS数据进行分析后，所获得的结构鉴定结果。

图6. ASO原药的MS2图谱(B)及其结构碎片归属(A)

图7. ASO代谢产物3’n-1的MS2图谱(D)及其结构碎片归属(C)

接下来我们看一个寡核苷酸在体外、体内的代谢产物分析及鉴定研究实例：

利用UPLC-UV-HRMS进行寡核苷酸Oligo A在体外孵育的肝S9和在食蟹猴连续给药4周后肝脏样品中代谢产物的分析和鉴定。结果显示，体外肝S9和体内肝脏样品的主要代谢产物有较好的匹配度。我们可以通过体外肝S9代谢产物鉴定结果推测体内代谢情况，并在此基础上开发出适合体内代谢研究的分析方法。

图8. Oligo A 在体外肝S9孵育48小时后的LC-UV代谢物谱

表3. 寡核苷酸Oligo A体外和体内代谢产物鉴定结果

（★：检测到；ND：未检测到）

图9. Oligo A 在体外肝S9孵育48小时和连续给药4周后食蟹猴肝脏中的代谢途径示意图

药明康德DMPK依托高分辨质谱技术及相关专业软件的支持，建立了体外血浆、肝S9、肝微体和动物体内血浆、尿液、粪便、肝、肾等多种生物组织中寡核苷酸（ASO和siRNA）的代谢研究和代谢产物鉴定平台。该平台已经为全球多家Biotech公司在寡核苷酸药物研发上提供助力，完成了多个临床前筛选项目及满足申报要求的IND项目，赋能寡核苷酸药物快速开发，造福患者。

代谢产物鉴定团队不仅可以进行寡核苷酸的代谢产物分析鉴定，还可以开展化学结构序列表征分析，进行寡核苷酸化学结构序列确认，帮助客户排除错配结构。

图10. 寡核苷酸序列覆盖分析图谱

结语

作为新型药物分子，寡核苷酸因其结构特点，具有极性大、带负电荷的特性，需借助化学修饰和递送系统改善其成药性；其在生物分析和代谢研究及代谢产物分析鉴定上也极具挑战。代谢产物分析鉴定对寡核苷酸药代动力学、毒代动力学和毒理研究以及药物临床安全性研究至关重要。基于此，药明康德DMPK建立了以UPLC-UV-HRMS技术为核心的寡核苷酸代谢及代谢产物分析鉴定研究平台，为客户提供高质量的代谢和代谢产物分析鉴定研究，助力客户的寡核苷酸药物研发快速推进。

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。 

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作者：覃耿垚，曹卫群

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟