PROTAC代谢研究策略和主要方法

药物代谢是指药物在多种药物代谢酶（主要存在于肝脏)的作用下结构发生改变的过程，又称生物转化，是药代动力学研究最为关注的内容之一。药物代谢按照代谢类型可分为I相代谢，主要包括氧化、还原或水解反应；和II相代谢，主要是结合反应。药物经代谢后，转变成无药理活性的代谢产物或仍然为有药理活性，甚至产生有毒的代谢产物。由此产生的代谢产物活性或安全性问题，一定程度上影响药物临床研究的成功或失败。

图 1：药物代谢的几种方式^[1]

对于近几年大热的蛋白降解靶向嵌合体即Proteolysis-Targeting Chimera（在上下文中简称为“PROTAC”）分子而言，同样存在代谢研究的考量。代谢研究的目的主要有以下几个方面：

1. 了解参与PROTAC代谢的酶主要有哪些；

2. 选择合适的体外代谢模型筛选PROTAC分子；

3. 通过代谢软点研究促进结构优化设计。

PROTAC研究历经二十多年，但是目前为止还没有一款PROTAC药物上市。专门总结PROTAC代谢研究的文献报道并不是很多。本篇文章结合文献报道和药明康德DMPK部门的研究经验，总结了PROTAC分子的代谢研究问题，希望对关注PROTAC分子的研究者有所帮助。

一、认识PROTAC代谢的关键代谢酶

研究PROTAC代谢，首先需要了解哪些酶可能参与其代谢。PROTAC化合物的分子量大约在600-1200之间，比常规小分子的分子量略大（符合Lipinski规则的化合物分子量一般小于500）。从化学组成上，是由两个小分子化合物通过Linker相连组成的三元复合物。尽管如此，PROTAC还是属于小分子化合物。常见参与小分子代谢的药物代谢酶主要包括I相代谢酶（CYP1A2，CYP2B6，CYP2C8，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6和CYP3A等）和II相代谢酶（尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGTs）和硫酸转移酶（SULTs）等）。其中以CYP450酶为代表的Ⅰ相代谢主要酶系，被认为参与了临床约50%药物的代谢^[2]。

图 2：CYP和non-CYP参与的药物代谢^[2]

Goracci等人^[3]报道，CYP3A4和醛氧化酶（hAOX）可参与PROTAC的代谢。CYP3A4参与PROTAC代谢并不意外，因为CYP3A4是CYP450酶中最主要的I相代谢酶。但醛氧化酶为主要在肝脏表达的胞浆药物代谢酶，属于non-CYP药物代谢酶。值得注意的是，醛氧化酶的代谢存在明显的种属差异，在大鼠中存在较大个体差异，在犬中几乎没有表达，而人体内表达最多^[4]。因此，醛氧化酶主要参与代谢的化合物，即使在动物体内代谢稳定，到人体内也很可能代谢不稳定。已经有一些候选化合物因为早期开发时忽视醛氧化酶代谢，进入临床后因清除过快、生物利用度过低被终止。从药物筛选的角度，醛氧化酶代谢需尽早鉴别。

图3：人醛氧化酶结构^[5]

虽然没有明确的文献报道全血中哪些酶参与PROTAC的代谢，但是根据体外血浆或全血稳定性试验数据，我们可以发现一些问题。体外血浆或全血稳定性也是PROTAC早期筛选的研究内容之一，我们发现PROTAC分子存在不同程度的全血稳定性问题。一般认为，全血中含有丰富的水解酶类，可催化药物的水解代谢。全血不稳定的化合物往往含有酯键、酰胺键、磺酰胺键、肽键等官能团。PROTAC分子在血浆或全血中不稳定，推测可能由于Linker或Linker连接位点不稳定所致。

总体而言参与PROTAC代谢的药物代谢酶，也是参与常规小分子代谢的I相或II相代谢酶。只是在代谢酶的种类上，需额外关注CYP3A4、醛氧化酶和全血中水解酶对PROTAC的代谢。尤其醛氧化酶不是一个常见的代谢酶。如图2所示，醛氧化酶和黄嘌呤氧化还原酶（XO）仅参与约3%上市药物的代谢。另外，全血中酶对PROTAC的代谢也是值得关注的内容，具体是哪些酶导致PROTAC在全血中不稳定还有待进一步研究。

二、选择合适的体外代谢模型

小分子体外代谢常用肝微粒体、肝细胞、肝S9等体系，也适用于PROTAC分子。可根据PROTAC代谢特点，选择合适的体外代谢模型。研究发现，有些PROTAC化合物分别采用肝微粒体或肝细胞得到的代谢速率可能存在较大差异，这一现象也在我们的研究中得到证实。肝微粒体主要含有I相代谢酶，当化合物主要被CYP酶代谢时，肝微粒体的代谢能够较好反映体内代谢的情况。但是当存在较强的非I相代谢时，肝细胞体系会更加合适。前述提到醛氧化酶是胞浆中药物代谢酶，在肝微粒体中含量较少。肝细胞含有膜屏障和完整的代谢酶系，是较为合适的PROTAC体外代谢研究体系。

图 4：PTOTAC的体外代谢研究模型

一旦发现醛氧化酶可能参与PROTAC的代谢，就需要专门研究醛氧化酶的代谢。由于醛氧化酶存在于胞浆中，可采用肝S9或肝胞浆体系进行研究。并同时考察加或不加醛氧化酶抑制剂情况下对化合物代谢的影响。如果有醛氧化酶参与代谢，加或不加醛氧化酶抑制剂得到的代谢速率会有差异。

前述提到PROTAC在全血或血浆中可能存在稳定性问题，最直接的评估方法就是考察PROTAC化合物在体外全血/血浆中稳定性，常规的孵育时间（最长2小时左右）基本能够满足PROTAC分子体外研究的需求。我们在研究中发现，全血和血浆得到的稳定性数据可能会存在较大差异。推测冻存的血浆与新鲜采集的全血，酶活性可能不同。在有条件的情况下，建议采用新鲜采集的全血进行代谢稳定性研究。

值得注意的是，PROTAC分子一般具有较高的蛋白结合率，在进行种属间比较或体外-体内外推（IVIVE）时需充分考虑化合物在孵育体系中游离率和全血中游离率数据。因此推荐对蛋白结合率进行准确测定后，再进行体外-体内外推。文献中依据IVIVE代谢预测模型，采用小鼠体外肝细胞数据计算理论体内清除率，发现绝大多数PROTAC分子的理论值落在实际值3倍以内，具有良好的体外-体内相关性^[6]。

图 5：肝细胞代谢的体外-体内相关性分析^[6]

三、代谢软点研究促进结构优化设计

PROTAC分子是由两个配体（Ligand）经由Linker相连组成的三元复合物。Linker部位断裂或两个配体部位的代谢，都是可能的代谢位点。Goracci等人^[3]比较了PROTAC分子及其组成配体的代谢软点和代谢速率，得出以下结论：

1. PROTAC的代谢软点与配体的可能完全不同；

2. PROTAC的Linker断裂是常见的代谢位点；

3. PROTAC的代谢速率与配体可能完全不同。

因此，很难用配体的代谢预测PROTAC分子的代谢。PROTAC的代谢研究，需要将其作为整体进行研究。

Linker部位断裂，是PROTAC不同于常规小分子的代谢类型^[6]。Linker断裂可产生两个配体相关的代谢产物。配体相关代谢产物，可能具有以下特征：

1. 代谢清除速率与PROTAC完全不同；

2. 因分子量较小，蛋白结合率比PROTAC更低；

3. 因为与靶点结合的部分仍是完整的，仍能结合靶点或E3连接酶。

如存在明显的Linker断裂型代谢产物，PROTAC的PK/PD研究需充分考虑代谢产物对药效的影响。此外，代谢产物可能产生的安全性问题，也根据需要进行研究。

图 6：PROTAC产生Linker断裂型代谢产物^[6]

结语  

PROTAC的代谢，可采用多种体外代谢模型进行评价和预测。目前而言，没有哪一种模型完全合适或不合适。文献报道采用肝细胞代谢数据进行体外-体内外推得到很好的预测结果，但这并不代表该方法就适用于所有的PROTAC分子。建议在实际筛选过程中，总结同系列PROTAC化合物的代谢特点，有选择性地进行代谢研究，找到适合自身PROTAC分子的体外代谢模型用于预测体内清除或化合物的早期筛选评价。针对PROTAC的代谢研究，我们期待更多经验被总结，从而深入了解PROTAC这类分子的代谢特征。

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作者：马利萍，金晶

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟