眼科药物生物分析中的5大挑战及解决策略

眼部疾病作为一类常见多发病，对患者生活质量可能产生严重影响，带来沉重的社会经济负担。在眼科药物的研发过程中，由于眼的结构复杂特殊，具有多重生理屏障，眼科药物的生物分析往往面临样本体积小、浓度低、真实空白样本难以获取等诸多挑战，本文将介绍眼的解剖结构、给药途径，并重点阐述眼科药物给药后的生物分析挑战及策略。

一、眼科药物相关研发背景

眼的基本解剖结构

如图1所示，从解剖结构上，以晶状体为界，可将眼球分为眼前段和眼后段，晶状体之前的眼结构称为眼前段，约占眼球的1/3，由角膜、结膜、虹膜、睫状体、晶状体和房水组成；晶状体之后的眼结构为眼后段，约占眼球的2/3，由巩膜、脉络膜、视网膜和充满玻璃体液的玻璃体组成。

图1. 眼球基本结构

常见眼部疾病

眼部疾病按病变部位可分为眼前区和眼后区疾病。眼前区的疾病主要包括白内障、青光眼和葡萄膜炎等。白内障是老年人最常见的眼部疾病，也是中国排名第一位的致盲性眼病，其主要病理改变是晶状体的浑浊变性，光线无法投射在视网膜上，导致视物模糊。青光眼是导致失明的第二大病因，主要与病理性的眼压升高有关，表现为进行性视神经损害，最终损伤视力。眼后区的疾病主要包括老年性黄斑变性、视网膜色素变性、糖尿病性视网膜病变等。糖尿病性视网膜病变即继发于糖尿病的慢性视网膜病变，主要表现为过度增生的毛细血管，病情发展到黄斑区会导致失明。

眼科药物的给药途径

眼科药物的给药途径可分为系统给药和局部给药。系统给药即药物经口服、肌肉注射和静脉注射等给药方式通过全身血液循环到达眼部，但是多数药物能够到达眼内的浓度极其有限。眼局部给药可以避免肝脏“首过效应”，药物可在局部作用而达到治疗目的，根据给药部位的差异可以细分为眼表给药、眼内给药和眼周给药。眼科药物的给药、采样、检查等技术我们已发布文章：眼科药物临床前体内PK研究：给药、采样、检查及制剂策略，欢迎阅读。

二、眼科给药后生物分析的挑战及策略

01 血浆暴露量低

眼部直接给药（例如眼表、眼内及眼周给药）或系统给药后，药物可通过血液循环到达靶组织。无论何种给药途径，均需要通过检测血浆中药物浓度来评价由于全身暴露导致的潜在药物毒性^[1]。由于系统给药存在与“血脑屏障”类似的“血眼屏障”，使外源药物难以进入眼内，所以眼部给药多采用局部给药方式。但由于眼局部用药体积小，且存在各种屏障，导致循环至全身血液中的药物含量通常较低，故需要开发高灵敏度的分析方法来检测血浆样本的药物浓度。这是眼科给药后测定血浆中药物浓度最大的挑战。针对这一难题，药明康德药性评价部从样品前处理、液相条件和质谱条件三个方面综合考量，开发了基于液质联用平台的高灵敏度的血浆药物浓度检测方法，为眼科局部给药后全身暴露量的评估提供了有效的解决方案。

图2. 眼科给药血浆暴露量低的优化策略

02 非特异性吸附

眼科药物研究中会产生很多特殊流体样本如房水、玻璃体液、眼泪等，存在潜在的非特异性吸附问题。非特异性吸附的发生主要与其组成成分有关：房水的主要成分为水，含有少量氯化物、维生素C、尿素、无机盐和蛋白质，其中蛋白质含量约为血浆的0.5%；玻璃体液的主要成分是水，其占比达到99%，含有少量无机盐、糖、蛋白质含量不足1%；眼泪中含有各种电解质、脂类和小分子代谢物，其中蛋白质含量约为血浆的10%~15%。由于这三种基质样本中蛋白质含量较低，所以药物容易在这些基质中出现非特异性吸附问题。针对这个挑战，后续我们会发布相关文章，欢迎关注。

03 空白基质难获取

眼科药物不仅要研究药物在全身的ADME情况，更应该关注药物在眼组织中的分布，所以在进行眼组织药代动力学研究时，需要对各组织/液体进行精细分离。在对眼组织样本进行生物分析时，由于眼组织样本体积较少，且不能剖杀大量动物获取足够的空白基质，因此空白基质难获取也是眼科项目分析的一大挑战。

针对这一挑战，主要从两个方面进行考虑：一是选择合适的生物替代基质，即采用与眼组织高度相似的替代基质，若无法获得高度相似的替代基质，可采用相近的可获取的生物基质作为替代基质，也可使用适合的试剂作为替代基质；二是购买商品化基质如人工泪液。研究表明可采用人工泪液作为替代基质分析兔泪液中那他霉素浓度，如图3所示，局部滴用那他霉素滴眼液（5%，w/v）后，兔泪液中那他霉素的时间-药物浓度曲线。

图3. 兔泪液中那他霉素的时间-药物浓度曲线，局部滴用那他霉素滴眼液（5%，w/v) ^[3]

04 眼泪样本的采集与分析

眼泪样本的生物分析挑战主要与其特殊的采集方式有关，目前主要有两种采集方式：毛细管法和滤纸条法。

毛细管法

取样时，毛细管轻轻接触下眼睑缘泪三角区域，泪液即可通过毛细作用进入管内。对于毛细管法采样，单次采集体积大约在10 μL左右。如图4所示，泪液样本体积少，而且样本常留存于毛细管内而难以吸取。如何准确吸取样本以及如何获得足够的空白基质进行样本分析是毛细管法采集方式带来的挑战。我们采用有机试剂对眼泪样本进行稀释处理，将样本充分润洗至样品管中，便于准确取样，同时使用有机试剂作为替代基质用于制备标曲及质控样本。

图4. 毛细管法采集的眼泪样本

滤纸条法

取样时，将滤纸条一端插入动物眼部结膜囊下，放置一定时间使泪液渗入。如图5所示，滤纸条是固体样本，且不能通过匀浆的方式获得可进样的液体状态。如何对滤纸条样本中的药物进行提取，获得可进样的液体状态，以及如何用滤纸条作为空白基质进行标曲及质控样本的制备是其主要挑战。对于这两个挑战，我们设计了如下流程，使用有机溶剂将滤纸条浸泡，并静置一段时间，将药物从滤纸条中提取出来，解决了滤纸条从固体形式转变为可进样的液体形式；其次对于标曲与质控样本的制备，我们选择替代的方式：将标曲和质控样本的工作液直接加入到含有空白滤纸条的上清溶液中进行后续分析，并对这种方法进行了数据验证。验证过程中标曲样本使用替代的方式获得，质控样本加在滤纸条上处理后提取做数据验证。如图6所示，验证结果表明，使用替代方式的实验准确度满足分析要求。

图5. 滤纸条法采集的眼泪样本

图6. 滤纸条验证实验

05 药物与黑色素结合

对于有色种属，眼黑色素位于睫状体和虹膜的前部，脉络膜的后部和视网膜色素上皮细胞内^[2]。药物一旦与黑色素结合就会形成一个小的药物储存库，缓慢释放到周围组织中，进而影响药物的药代动力学、有效性和安全性。对于生物分析，若药物与黑色素结合会带来检测浓度不准的潜在风险以及不稳定假象，是一个较大的挑战。

解决策略主要从以下3方面考虑：

1. 加入高浓度的盐如 NaCl、MgCl₂ ，其原理是利用金属阳离子与黑色素结合，与化合物竞争结合位点^[2]，从而将化合物释放出来。图7展示了不同金属阳离子对诺氟沙星 (NFLX) 从黑色素-药物复合物中解离的影响^[4]。
2. 改变pH, 对于 pKa 值大于9的弱碱性药物，pH 值降至7以下不会影响药物的电离，但黑色素电离发生变化，从而降低药物与黑色素的结合率^[2]。
3. 加入蛋白裂解液，破坏黑色素表面蛋白水合，进而破坏其结构，同时不影响小分子药物结构，降低结合率将化合物释放出来。

图7. 金属离子对诺氟沙星 (NFLX) 从

黑色素-药物复合物中解离的影响^[4]

结语

由于眼科给药存在各种屏障，药物面临难以到达靶组织发挥药效且药物作用时间短等挑战，伴随着脂质体、纳米颗粒等前沿载药体系的发展，药物的作用持续时间得到有效延长。针对眼科药物的新兴药物类型如寡核苷酸和外泌体等也不断被开发，给眼科患者带来新的光明。这些前沿技术的发展对于眼科药物的生物分析也将提出更多挑战，我们将实时关注业界前沿进展，完善服务能力建设，助力更多眼科药物研发。

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。 

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作者：李婷婷，符新发，任彦甫，邢丽丽

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹