siRNA药物非临床早期体内药代动力学研究中的一体化生物分析策略

小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）为19~23个碱基对的双链RNA分子。在生物体中，siRNA介导的RNA干扰（RNA inferences, RNAi）所引起的基因沉默，是一种重要的基因表达调控方式，其可特异性引发靶mRNA降解，抑制基因表达。目前已有5种siRNA药物上市获批，并且有越来越多的siRNA药物进入临床研究阶段。相比较于IND申报阶段，早期体内药代动力学研究需要多元化的生物分析平台，以支持包括血浆/组织中siRNA暴露量、siRNA的组织分布、siRNA结合细胞质中包括Argonaute (Ago)蛋白在内的其他多种蛋白质形成的RNA诱导沉默复合体浓度、靶mRNA的降解效率，及目标蛋白的抑制效率等研究。

本文针对siRNA药物非临床早期体内药代动力学研究的关键分析物，提供了相关的生物分析解决方案，以期为siRNA药物非临床体内药代动力学实验提供可靠的数据及决策依据，加快siRNA药物非临床研究。

一、siRNA药物一体化生物分析

siRNA中能与靶基因mRNA互补配对的一条链为反义链 (Antisense strand, AS)，另一条链为正义链 (Sense strand, SS) 。如图1所示，siRNA药物通过内吞进入细胞内与 Argonaute (Ago) 等蛋白质因子结合，形成RNA诱导的沉默复合体 (RNA-induced silencing complex, RISC) 。RISC复合体中反义链被保留，正义链被剪切并降解。siRNA通过碱基互补配对识别靶基因mRNA，Ago利用其核酸内切酶活性切割靶基因RNA，产生的RNA片段易受到5′或3′核酸外切酶的攻击而快速降解，从而在转录后水平沉默靶基因。siRNA作为一种具有新型作用机制的药物，在罕见病、癌症、代谢紊乱等疾病的治疗中有广阔的前景。随着2018年第1款siRNA药物的获批上市，siRNA药物的研发热潮不断高涨。截至2023年，全球在研siRNA药物超过200个。siRNA药物的非临床早期体内药代动力学研究是药物开发过程中的重要的组成部分，用于研究siRNA在生物体内的吸收和分布，建立药效/药代动力学的模型。siRNA药物的非临床早期体内药代动力学研究包括siRNA血浆PK (pharmacokinetics, PK) 、组织PK、RISC-siRNA复合体PK、靶基因mRNA 的降解效率、靶蛋白的抑制效率，其生物分析包括siRNA、RISC-siRNA复合体、基因表达和蛋白水平分析，因此需要包括多个分析平台支持不同分析物的定量检测。

图1. siRNA介导的基因沉默机制 ^[1]

血浆/组织中siRNA浓度

大部分siRNA药物通过皮下或静脉注射给药，其血浆半衰期短，0.25-2个小时达到最大峰浓度，然后快速被清除^[2]。通常在非临床早期体内研究中，缺少siRNA相关的代谢研究，因此为避免代谢产物对siRNA药物浓度检测的干扰，血浆中siRNA的浓度可采用液相色谱-三重四极杆质谱联用（LC-MS/MS）进行定量检测（见文章:液相色谱-质谱联用在寡核苷酸药代动力学定量分析中的应用）。在变性条件下，双链结构的siRNA经过变性可产生正义和反义链两个单链，质谱可以分别同时检测到两个单链，其在血浆中检测灵敏度可达5-10 ng/mL。针对不同递送系统偶联的siRNA，还应根据其结构选择适合的生物分析方法，如基于杂交的液相-荧光检测（LC-FL）、配体结合检测（LBA）和定量聚合酶链反应（qPCR）以满足定量要求。

siRNA的组织分布

siRNA药物主要分布在有限数量的组织中，包括肝脏、肾脏、肾皮质和淋巴结等, 在肝脏中具有较高暴露和长半衰期^[2]。siRNA药物的血浆峰浓度和最大效应之间通常存在7~14天的滞后，并且血浆动力学过程和靶组织中效应动力学过程在时间上不一致^[3]。因此对siRNA的组织分布及组织PK研究，对于非临床早期体内药代动力学研究十分重要。组织中的siRNA浓度可采用LC-MS/MS方法对摘取的组织分别进行定量，其分析方法与血浆样品分析方法类似。在组织匀浆中，需要对不同类型的组织采用不同的匀浆方案。此外，还可以采用成像方法对标记的siRNA进行组织分布研究，例如对花菁染料Cy5或Cy7标记的siRNA通过荧光成像进行组织分布研究。成像方法避免了器官摘取过程中的放血和交叉污染，且保留了组织结构信息，但空间分辨率有限，且检测灵敏度低于LC-MS/MS方法。

细胞内RISC-siRNA复合体浓度

siRNA进入体内后首先需要与细胞内Ago等蛋白质因子结合形成RISC，双链中的AS链保留，SS链被快速降解，随后在RISC中的AS链与目标mRNA结合才能诱导mRNA降解，抑制蛋白的合成。而这一过程可能需要十几个小时甚至数天才能达峰，因而会出现药效滞后的现象，所以RISC-siRNA的复合体浓度与药效的关系更密切。由于这RISC-siRNA的复合体的含量极低，可能会在1ng/g以下，需要具有更高灵敏度的分析方法实现定量检测。通过RNA免疫沉淀配合茎环法RT-qPCR (reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR) 的方法可以实现RISC-siRNA复合体的检测。这是在现有的茎环法上的进一步衍生，目的是特异性检测RISC复合体中的siRNA，方法主要分成3步。首先，将连接protein A/G的磁珠与Ago2抗体结合，然后特异性地捕获Ago2与RNA的复合物，洗涤和洗脱之后，得到与Ago2蛋白结合的siRNA，然后通过茎环法RT-qPCR的方式进行检测^[4]。该方法的灵敏度可达0.25-1 ng/g。

靶基因mRNA的降解效率

siRNA的作用机理在于引起靶基因mRNA的降解，因此mRNA的降解水平是siRNA沉默效率的直接证明。通过RT-qPCR方法，以表达稳定的管家基因为参照，对靶基因mRNA的表达量进行相对定量，从而检测靶mRNA的降解效率。实验流程分为3步，先从组织中提取total RNA，在反转录酶的作用下合成互补的cDNA (complementary DNA, cDNA)，然后通过加入引物和检测试剂，进行PCR扩增和检测。检测方式一般有两种，SYBR Green染料法和Taqman探针法。SYBR Green是一种核酸染料，它在游离状态的荧光很弱，当嵌合进入双链分子中时，荧光会大大增强，利用这一特性可以进行定量检测。这种方式的通用性较好、灵敏度高、经济、便捷，但特异性相对较差，可能会出现非特异性的扩增，影响定量的准确性。Taqman探针法利用的是引物延伸的过程中，探针被水解，释放出荧光基团从而产生荧光的原理进行检测。由于探针和目标序列是特异性结合，因而这种方式特异性强，重复性好，而且可以在一个反应中进行多重qPCR分析，减少上样误差，它的缺点是需要针对每个待测基因设计探针，因而通用性较差，成本较高。

靶蛋白的抑制效率

siRNA引起靶基因mRNA的降解，从而影响了靶蛋白的表达。但蛋白水平受体内蛋白表达量、稳定性、半衰期及其他调控因素的影响，靶蛋白水平下降的幅度与mRNA水平下降不一定成线性正比。靶蛋白水平可以通过ELISA，Western blotting或LC-MS方法进行检测。使用ELISA检测靶蛋白时，需要考虑关键试剂的可获取性。当难以获取时，可采用Western blotting或LC-MS方法进行检测。

二、案例分享

siRNA-X是一个与GalNAc偶联的siRNA，AS链3’ 端具有不对称RNA/dTdT悬挂（图2），靶向C5补体通路，通过抑制肝脏产生C5补体蛋白来治疗补体介导的疾病。

图2. siRNA-X结构

我们按照常规的siRNA药物早期体内实验方案开展了小鼠的药代动力学研究，通过皮下注射单次给药后在多个时间点取血和肝脏进行分析。具体实验设计如图3所示：设置低\中\高3个各剂量组，单次给药后，在1、6小时以及1、2、3、7、14和21天安乐小鼠以收集生物样品。

图3. siRNA-X小鼠药代动力学实验设计及生物分析解决方案

在这个实验中采用了3种不同的分析平台4个生物分析方法对样品进行分析：

1. 利用LC-MS/MS的方法对siRNA的血浆及肝脏浓度进行定量检测(图4)；

2. 利用ELISA对血清中的C5补体蛋白水平进行检测 (图5)；

3. 利用RNA免疫沉淀配合茎环法RT-qPCR对肝脏中的RISC-siRNA的复合体浓度进行定量检测；

4. 利用茎环法RT-qPCR的方法对肝脏中靶基因进行检测。

图4. 利用LC-MS/MS方法检测不同剂量组siRNA-X在小鼠肝脏中浓度

图5. 利用ELISA对血清中的C5补体蛋白水平进行检测

通过对肝脏组织RISC-siRNA复合体进行检测，并与靶蛋白或是靶基因mRNA的抑制率/降解比较(图6和图7)，可以发现相较于游离血浆药物浓度，RISC-siRNA复合体浓度与靶细胞中基因沉默效应更加相关。

图6. 小鼠肝脏中RISC-siRNA复合体浓度 v.s. C5补体蛋白抑制率

图7. 小鼠肝脏中RISC-siRNA复合体浓度 v.s. 靶基因mRNA降解效率

结语 

药明康德药性评价部Non-GLP生物分析团队具备全面的寡核苷酸药物生物分析能力，开发并建立了包括：液相色谱-三重四极杆质谱联用（LC-MS/MS），液相色谱-高分辨质谱联用（LC-HRMS），基于杂交的液相-荧光检测（LC-FL），配体结合检测（LBA），和定量聚合酶链反应（qPCR）5大生物分析平台，支持从早期药物筛选到IND申报的寡核苷酸生物分析，提供多样化的生物分析解决方案，具有丰富的寡核苷酸生物方法开发经验，可以实现高质量的体内外数据交付，加速药物研发进程。以深耕技术、卓越分析为理念聚焦分析新能力建设，以跨区域协同、规模化、全流程、一体化的服务优势持续打造领先的非临床Non-GLP生物分析服务。

图8. 药明康德DMPK寡核苷酸生物分析平台

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。 

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作者：赵楠, 蒋嘉明, 李陟昱, 邢丽丽

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹