RT-qPCR技术在寡核苷酸DMPK定量分析中的应用

RT-qPCR技术因其具有超高灵敏度, 较宽的线性范围，高通量, 样品用量少, 在寡核苷酸药物定量分析中显示出其独有的优势, 除了可以检测靶向mRNA的水平变化, 还可以用于低浓度样品的PK分析及RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）中结合的siRNA的定量分析。本文将介绍相关逆转录qPCR（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）技术的原理，优点及挑战和解决方法，基于部门经验与研究案例分享一些见解。我们将发布系列文章分别介绍寡核苷酸药物的生物分析平台，目前已发布了LC-MS, LC-FL及LBA分析方法的专题文章。

一、利用RT-qPCR技术检测寡核苷酸的原理

qPCR（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）是指在聚合酶链反应中引入荧光基团标记的探针或核酸染料，使得每一反应时刻的荧光信号能够进行实时分析，且由于荧光信号的强度与PCR产物量成正比，通过计算可得出起始模板量，因而可用于核酸的定量检测。qPCR是公认的己知序列核酸定量检测的标准方法之一。对于RNA的定量分析，通常采用RT-qPCR技术。RT-PCR方法首先以RNA为模板，在逆转录酶的作用下合成互补DNA（complementary DNA, cDNA），再以cDNA为模板通过PCR反应进行扩增。此外，也有一些不需要逆转录的qPCR技术，如基于连接酶的qPCR技术。

寡核苷酸通常只有19-25个碱基，由于序列短，无法通过常规的方式设计引物和探针实现核苷酸序列的扩增。因此要延长待测寡核苷酸的长度，构建出一个足够长的PCR模板，才能进一步应用PCR技术来定量分析。为了解决这一难题，衍生出了一些延伸待测核酸序列的方法，如茎环法、PolyA聚合酶加尾法、连接法、引物延伸法等。其中，茎环法和PolyA聚合酶加尾法是两种较为常用的方法。

1.茎环法

茎环法（Stem-loop reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, SL-RT-qPCR）最早由Chen等在2005年报道。茎环法有别于常规的RT-qPCR之处在于其通过设计一种特殊的逆转录引物，在逆转录反应中直接完成模板链的延长。这一逆转录引物包含一个“茎环”结构和一段与目标寡核苷酸特异性互补的序列。逆转录引物通过与目标寡核苷酸的 3’端~6 nt的互补配对，在逆转录酶的作用下合成cDNA，实现模板链的延长。随后，可针对延长的cDNA模板设计正反引物以及Taqman探针，用于定量PCR扩增和检测。茎环引物因其特殊的结构，可以增加逆转录引物和目标寡核苷酸的稳定性，减少与内源性RNA或DNA的非特异性结合。特殊设计的6-8个特异性配对碱基同时可以增加序列的特异性，减少背景噪音信号。利用这一方法可以实现7-8个数量级的宽线性范围，且定量下限可低至约2 pg/mL。

图1. 茎环法原理

2. PolyA聚合酶加尾法

PolyA聚合酶加尾法是指在PolyA聚合酶的作用下，在目标寡核苷酸3’端加上一段寡聚腺苷酸尾巴，再用一个通用的逆转录引物逆转录生成cDNA，实现模板序列的延长。这个逆转录引物包含三个关键的结构: (1)与PolyA序列互补配对的一段Poly T序列; (2) 位于5’端的一段通用序列, 用于PCR过程中反向引物与cDNA的结合; (3) 位于3’端的一个或两个锚定碱基，使逆转录引物特异性地结合到紧挨着目标寡核苷酸的那段PolyA序列上。随后，可通过特异性的正向引物和通用的反向引物序列进行PCR扩增，采用SYBR Green法进行定量检测。加尾法的最大优势在于操作相对简单，无需设计特殊的逆转录引物，可以在一个逆转录反应中同时对多个目标序列进行逆转录，因而成本相对较低。但弊端在于特异性较差，可能导致准确度降低。

图2. PolyA聚合酶加尾法原理

3. 引物延伸法

引物延伸法利用一个可以特异性加尾的引物进行逆转录合成cDNA，cDNA包含一段与目标寡核苷酸特异性配对的3’端碱基序列和一段5’端通用序列。随后通过一对通用的正向引物和特异性的反向引物，采用SYBR Green染料法进行PCR扩增和检测。该方法的关键在于一个经修饰的约15 nt的反向引物。该反向引物5’端前8个碱基中的2-3个被替换为一种特殊修饰的核酸类似物——锁核酸（Locked nucleic acid，LNA）。LNA是一种含有双糖环的核苷酸衍生物，通过 2’氧原子和 4’碳原子之间的亚甲基桥键，将糖环锁定成为一个双环的分子模式，从而能很好地限制糖环的灵活性，但不影响其遵循Watson-Crick碱基配对原则，其表现出更强的结合亲和力、序列特异性、热稳定性和核酸酶抗性。利用该方法进行检测，其灵敏度通常能够达到fM级别，并拥有6-7个数量级的线性范围。但其采用SYBR Green的检测方式会受到非特异性结合的影响。

图3. 引物延伸法原理

4. DNA探针结合法

该方法保留了qPCR过程，但改变了cDNA的合成过程，不需要通过逆转录的方式，而是利用DNA连接酶，如T4 DNA连接酶或SplintR连接酶等，具有补平缺口，形成完整cDNA的能力，可以无需逆转录过程即可实现目标序列延长的目的。该技术根据RNA序列设计两条DNA探针，分别包含RNA识别序列以及PCR前后引物序列。当存在RNA序列时，通过碱基互补配对两个探针与RNA序列杂交，随后在DNA连接酶的作用下形成一条完整的、长度延伸的cDNA模板序列，用于后续PCR定量。然而，DNA连接酶能够非特异性将两个DNA探针连接，形成非特异性扩增信号。同时以RNA为模板，DNA连接酶连接DNA探针的效率较低， 因此可能会影响特异性和灵敏度。

图4. DNA探针结合法原理

二、RT-qPCR技术用于寡核苷酸定量检测的优点

1. 超高的检测灵敏度和较宽的动态线性范围

RT-PCR是一种用于放大扩增特定的核酸片段的分子生物学技术，能够在短时间内使微量的目标检测物扩增放大数百万倍，因而具有超高的灵敏度。在寡核苷酸药物的检测中，定量下限可以达到pg/mL水平，远低于质谱检测的ng/mL水平。寡核苷酸药物具有高效性和长效性的特点，在血浆中的消除速率较快而在靶组织中的半衰期较长，对用于低剂量组或长实验周期的血浆样品检测，需要灵敏度更高的检测方法。此外RT-qPCR用于定量的动态线性范围宽，通常可达到7-8个数量级以上, 可以兼顾高低丰度样品的生物分析。

寡核苷酸药效学关键指标（如靶细胞中基因沉默效应/相关蛋白水平变化）与RNA诱导沉默复合体结合的siRNA的暴露量相关, 但通常与RISC结合的siRNA的浓度极低, 需要超高灵敏度的检测方法（检测限低于50 pg/mL）。RT-qPCR技术的超高灵敏度可以检测与RISC结合的siRNA, 可以为siRNA细胞内递送和RNA沉默机制提供相关数据（后续还将发布相关案例分享的文章，欢迎持续关注）, 建立药效学关键指标和RISC结合的siRNA PK的PD/PK模型, 更好地帮助药物设计和优化和预测人体有效剂量。

2. 可实现较高通量的样品分析, 并减少生物样品的使用

在RT-qPCR加样过程中尤其在配置96孔或者384孔反应板时，采用高通量高精度的自动化移液系统来进行实验体系构建，快速制备反应体系，可以避免在高压工作下人工疲劳操作带来的不均一性，减小实验误差，并提高样本处理效率。同时还可以帮助研究人员降低试剂使用的成本。使用RT-PCR技术，大约仅需10µL的生物样品，相比于其他检测方法可以有效节省样本用量，使得这些样本可以进行多次分析。

三、RT-qPCR技术用于寡核苷酸定量检测的挑战和解决方案

1. 引物和探针设计

开发RT-qPCR的方法检测寡核苷酸药物的难点之一在于引物和探针的设计。引物和探针的质量会极大地影响检测的灵敏度。对于SL-RT-qPCR，虽然有通用的逆转录引物、PCR反向引物和探针序列可供选择，但正向引物需要根据不同的寡核苷酸序列针对性地设计。由于原序列较短，导致引物序列的选择和长度有限，Tm值难以符合要求，通常可在5’端增加一段G或C序列来使Tm值接近60℃。同时，需要尽可能避免引物与引物以及引物与探针之间形成二聚体，导致扩增效率或结果异常。另外，还需要注意引物对的Tm尽量接近，而探针的Tm值要比引物高5-10℃。若通用引物和探针无法满足要求，可根据序列针对性地设计。此外，由于探针合成周期较长，通常在方法开发阶段需要设计2-3对引物和探针用于筛选，导致成本增加。

2. 需要严苛的操作环境和耗材

由于RT-qPCR检测非常灵敏，甚至可以检出仅数个拷贝的目标序列，因而受环境和耗材洁净程度的影响较大，在实验过程中需要严格避免气溶胶的污染以及核酸酶的干扰。

3. 代谢产物可能会影响方法的准确性

尽管qPCR检测方法灵敏度高，但缺乏对生物样品中待测寡核苷酸的特异性，无法区分全长寡核苷酸和长链代谢物，如n-1和n-2。这可能会导致逆转录引物与代谢物结合实现非特异性扩增，导致待测寡核苷酸浓度被高估，影响方法的准确性。

4. 化学修饰或载体可能会影响灵敏度和准确性

有研究表明一些化学修饰，如GNA（Glycol nucleic acid）修饰的siRNA会降低RT-qPCR的检测灵敏度。可能这类无环三碳碱基不是逆转录酶的天然底物，导致逆转录效率降低。因而针对这类寡核苷酸药物需要进行特殊的优化，如改变反应体系中的离子浓度等。 

5. 缺少来自监管机构的指导建议

目前FDA和NMPA 尚未要求对 qPCR/RT-qPCR 分析方法进行验证，有关于实验设计或评估过程的概述以及样品分析的验收标准也没有统一的标准。因此在进行临床和非临床研究中, qPCR/RT-qPCR 方法验证和样品分析的接受标准会根据生物分析科学家的科学理解而不同。

四、利用SL-RT-qPCR方法定量分析GalNAc-siRNA案例分享

我们开发了具有超高检测灵敏度的SL-RT-qPCR方法，对大鼠血浆中GalNAc-siRNA进行定量分析，并对方法的特异性、选择性、灵敏度、线性范围、准确度和精密度进行了方法学验证。该方法采用一个特异性的茎环引物与GalNAc-siRNA双链中的反义链互补杂交，通过反转录得到延长的cDNA，随后通过基于TaqMan探针的qPCR反应检测反义链的浓度，GalNAc-siRNA的浓度将根据反义链的浓度进行报告。该方法具有良好准确度和精密度。

1. 标准曲线和定量范围

本方法展现出了出色的灵敏度和较宽的动态范围，LLOQ低至0.01 ng/mL，线性范围在0.01-50 ng/mL之间。该方法扩增效率在90%-110%之间。

图5. GalNAc-siRNA在大鼠血浆样品中的扩增曲线

图6. GalNAc-siRNA在大鼠血浆中的校准曲线（0.01-50 ng/mL ; R2 = 0.999）

2. 准确度和精密度

质控样品的批内准确度范围为78.2%至115.2%，批间准确度范围为91.8%至100.7%；批内精密度%CV范围为2.7%至15.0%，批间精密度%CV范围为11.6%至 12.8%。

结语

基于寡核苷酸药物研究经验，以及各国药监部门发布的关于寡核苷酸药物开发的注意事项及前沿文献研究，我们建立qPCR/RT-qPCR 方法开发和验证的实验体系, 并开发了具有超高的灵敏度以及相对良好准确度和精密度的RT-qPCR生物分析方法，可用于筛选阶段和临床前药代动力学生物样品中寡核苷酸的定量分析以及建立PD/PK模型分析。

药明康德药性评价部Non-GLP生物分析团队具备全面的寡核苷酸药物生物分析能力，开发并建立了包括：液相色谱-三重四极杆质谱联用（LC-MS/MS），液相色谱-高分辨质谱联用（LC-HRMS），基于杂交的液相-荧光检测（LC-FL），配体结合检测（LBA），和定量聚合酶链反应（qPCR）5大生物分析平台，支持从早期药物筛选到IND申报的寡核苷酸生物分析，提供多样化的生物分析平台，具有丰富的寡核苷酸生物方法开发经验，可以实现高质量的体内外数据交付，加速药物研发进程。我们坚持以深耕技术、卓越分析为理念聚焦新分析能力建设，以跨区域协同、规模化、全流程、一体化的服务优势持续打造专业的临床前Non-GLP生物分析服务。

图7. 药明康德DMPK寡核苷酸生物分析平台

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。 

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作者：崔倩, 蒋嘉明, 赵楠, 邢丽丽

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟