上市siRNA药物ADME研究概况及数据解读
从2018年至今，多个小干扰RNA（siRNA，small interfering RNA）药物获批。本文根据上市siRNA药物的申报资料，总结了siRNA药物申报中开展的体内外药代动力学研究项目。从药物吸收（absorption）、分布（distribution）、代谢（metabolism）、排泄（excretion）及药物相互作用（Drug-drug interaction，DDI）等五个方面，分别总结了五款上市药物的实验设计及数据特点，为siRNA候选分子开展研究提供参考。
至今共上市了五款小干扰RNA药物，这五款药物均靶向递送至肝脏治疗相关疾病。2018年第一款siRNA药物Patisiran上市，是由两条部分互补的单链组成的siRNA和四种脂质赋形剂组成的脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle，LNP），siRNA被包裹在LNP中，以保护它不被内源性核酸酶降解，并促进其靶向传递到肝脏。之后2019-2022四年间上市的四款siRNA药物，则采用N-乙酰半乳糖胺（N-Acetyl-D-galactosamine，GalNAc）修饰递送系统。脂质纳米颗粒LNP靶向递送一般通过静脉（Intravenous，IV）注射给药，而GalNAc修饰递送系统一般采用皮下（Subcutaneous，SC）给药的方式（表1）。
表1. 上市siRNA药物简介
对于siRNA药物，大多数已批准和临床后期的siRNA含有PS（硫代修饰）和多个2'-OMe和2'-F修饰（表2）。其体内外药代动力学性质和这些修饰密切相关。
表2. 上市siRNA药物及其结构修饰a
a. 表中括号内数字代表siRNA中各化学修饰数目。
一般体内给药后，siRNA药物先进入血液循环，然后在肝肾器官作用下发生代谢或排泄（图1）。下面我们从吸收、分布、代谢、排泄及药物相互作用等几个方面介绍这五款siRNA药物申报材料中提供的药代动力学研究数据，并对部分数据进行相应解读。
图1. siRNA药物给药后的体内处置过程[1]
一、上市siRNA药物的吸收
a. 几款上市siRNA药物在临床前是如何开展吸收实验的？
吸收描述药物如何从给药部位到达体内的过程，药物进入系统循环之后进一步由血液运输到全身。Patisiran采用静脉注射给药的方式，在雌雄SD大鼠和雌雄食蟹猴中测试了低、中、高三个剂量下给药后的血浆药物浓度，以评估siRNA及两种新型脂质成分在静脉给药后的药代动力学特征。Givosiran、Lumasiran、Inclisiran 和Vutrisiran四款GalNAc修饰的siRNA则在雌雄SD大鼠和雌雄食蟹猴中分别进行了单剂量静脉、多剂量下单次及重复皮下给药，以评估siRNA在静脉给药及皮下给药后的药代动力学特征。
b. 为何Patisiran选择静脉给药，其他四款GalNAc修饰的siRNA采用皮下注射给药？
寡核苷酸药物研发面临的主要挑战之一是如何实现对靶组织的充分暴露。与大多数小分子药物不同，寡核苷酸药物在胃肠道中不易被吸收，一般采用静脉注射或者皮下注射的方式达到靶组织的充分暴露。
脂质纳米颗粒包裹的Patisiran颗粒大小大约为60-100 nm，该大小的LNP药物在静脉给药后肝脏的暴露水平要远高于皮下给药[2]，因此临床前和临床测试中采用静脉给药的方式给药。Patisiran静脉给药后，在血浆载脂蛋白APOE的帮助下转运到肝脏达到肝脏靶向给药的目的（图2）。
图2. LNP-siRNA主要机理[3]
Givosiran、Lumasiran、Inclisiran 和Vutrisiran采用N-乙酰半乳糖胺（N-Acetyl-D-galactosamine，GalNAc）修饰的递送系统（图3），去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR，Asialoglycoprotein receptor）是一种内吞性受体，在肝细胞的膜表面高度特异性地表达。GalNAc是去唾液酸糖蛋白受体的配体，GalNAc修饰的siRNA给药后经ASGPR介导发生细胞内吞而进入靶组织。ASGPR在肝细胞上大量表达，每个细胞有大约500,000个受体[4]，存在一定的饱和性，静脉给药后药物直接进入血液，浓度较高，容易导致ASGPR饱和致使进入肝细胞的药物分子减少。皮下给药存在一定的缓释效果，药物分子可以较为缓慢的进入肝细胞而达到充分暴露的目的。
图3. GalNAc-siRNA靶向肝脏主要机理[5]
c. 上市siRNA药物吸收药代动力学数据总结及解析
以人体给药后的血浆药代动力学数据为例，Patisiran单次静脉给药后血药浓度-时间曲线呈现二房室模型特征（图4），静脉输注给药后血药浓度迅速下降，随后出现二次达峰和线性消除。最初的下降可能是由于药物进入血液循环后在组织中快速分布，大部分Patisiran药物分子从循环系统进入肝脏。随后，Patisiran分子从肝脏再回流到血液循环系统导致Patisiran血浆浓度的二次升高。Patisiran的t1/2末端消除半衰期约为2-3天[6]，表观分布容积和血浆清除率相对较小（表3），在人体中的血浆暴露量AUC显著高于大鼠和猴。
图4.上市siRNA药物人体给药后的药代动力学曲线[7-11]
Givosiran、Lumasiran、Inclisiran和Vutrisiran在单次静脉给药后，在大鼠和猴体内的药代动力学相似，t1/2末端消除半衰期约为0.2-0.6 h，表观分布容积和血浆清除率相对较小（表3）。Givosiran、Lumasiran、Inclisiran和Vutrisiran在大鼠、猴和人单次皮下给药后，血浆Tmax值在0.4-6小时之间，在人体达峰稍慢一些，消除半衰期在1-9.58小时之间，在人体中消除半衰期比大鼠和猴长一些。大鼠的生物利用度在5%和35.1%之间，猴的生物利用度在8%和25%之间（表3）。系统性暴露量（以血浆Cmax和AUC0-t值计)随着剂量增加，大致成比例增加，且雌雄动物给药后未发现明显的性别差异。皮下吸收后，血浆药代动力学曲线基本呈现二房室模型特征[4-8]。
表3. 上市siRNA药物主要药代动力学参数
SC = Subcutaneous, R = Rat, C = Cynomolgus monkey, H = Human；M = Mouse. 该缩写适用于后续所有表格。
二、上市siRNA药物的分布
a. 几款上市siRNA药物在临床前研究中如何评估药物分布？
体外研究可以帮助理解化合物分布的细节。例如，渗透性测定可以表征化合物进入细胞的潜力，血浆蛋白结合（Plasma Protein Binding，PPB）研究可以量化与血浆蛋白的结合程度，较高的血浆蛋白结合率可能限制治疗作用，限制与靶标作用的游离药物浓度。Patisiran在评估药物与血浆蛋白结合率时主要采用快速蛋白质分析液相色谱法结合聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法（FPLC followed by SDS-PAGE），而其他几款siRNA药物则采用电泳迁移率实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）。
药物从给药部位进入体内后，体内药物的分布描述了药物从一个位置到另一个位置的可逆转移。一般通过组织采集或者放射性标记的体内ADME研究，包括定量全身自显影技术（Quantitative Whole-Body Autoradiography，QWBA）等，获得各种组织和器官随时间变化的药物浓度变化。这几款上市的siRNA药物在体内测试中，主要采用了未标记化合物给药后采集主要组织，或放射性标记的体内QWBA研究技术评估siRNA药物的体内分布。
b. 上市siRNA药物分布数据总结及解析
体外蛋白结合率数据显示，脂质纳米颗粒包裹的Patisiran与血浆蛋白结合率比较低，与白蛋白和alpha-1-酸性糖蛋白的结合率也较低，而单独的脂质成分PEG2000-C-DMG则与血浆蛋白存在比较高的结合率。Givosiran、Lumasiran、Inclisiran和Vutrisiran与血浆蛋白结合程度存在浓度依赖关系，浓度越低，蛋白结合率越高，浓度升高，则蛋白结合率下降（表4）。
表4. 上市siRNA药物体外蛋白结合率数据
从收集到的上市siRNA药物体内组织浓度数据来看，这几款siRNA药物均存在肝靶向的特征，给药后肝组织的暴露量（AUC或Cmax）显著高于血浆中的暴露量。GalNAc修饰的siRNA肝脏的暴露量比Patisiran高很多（表5）。
表5. 上市siRNA药物靶组织浓度数据
从同位素标记的QWBA测试结果来看，这几款上市的siRNA药物以肝脏分布为主，其他血流丰富的组织比如肾脏和免疫器官淋巴结等也有较多的药物分布（表6）。
表6. 上市siRNA药物同位素标记分子QWBA结果
三、上市siRNA药物的代谢
寡核苷酸药物主要被血浆和组织中广泛存在的核酸内切酶和核酸外切酶所代谢，而不是通过肝脏的Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶代谢[18]。对于双链siRNA来说，核酸外切酶作用于链的末端，导致单核苷酸的释放，而核酸内切酶则在链内裂解，产生不同长度的链。GalNAc-siRNA给药后，GalNAc片段一般在内质网/溶酶体运输过程中被β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶快速水解，连接子可以进一步被肝细胞中的酰胺酶代谢[19]。目前上市的siRNA经过结构改造后，在血液循环中较少被代谢。通常绝大部分siRNA被肝脏迅速摄取，小部分分布在其他组织，在肝脏或其他组织中经由核酸酶代谢。
a. 上市siRNA药物在临床前研究中如何评估药物代谢？
如表7和表8所示，表中总结了上市siRNA药物的体内外代谢研究结果。对于体外代谢研究，一般进行肝S9和血清/血浆稳定性实验。对于体内代谢研究，通常是收集体内PK研究中产生的血浆和肝脏组织进行代谢物谱图分析。GalNAc-siRNA的代谢物谱图分析会分别对AS链和SS链进行考察，而LNP包裹的siRNA药物Patisiran除考察双链siRNA的代谢外，还额外考察了两种新型脂质分子的体内外代谢。
表7. 上市siRNA药物体外稳定性数据a
a. 表格中数据为各siRNA在血清或肝S9基质中孵育24小时后AS或SS的剩余百分比。
b.游离的siRNA在血清和S9基质中孵育6或24小时后剩余量。
c. LNP包裹的siRNA在血清中孵育24小时后剩余量。
d. 表明该值包含了大鼠，小鼠，猴和人种属的数据。
b. 上市siRNA药物代谢数据总结及分析
上市siRNA药物的体内和体外代谢数据表明，siRNA药物的体外和体内代谢表征结果相似，而且在包括人种属在内的各个种属间有着相似的代谢途径和代谢物（表7和表8）。siRNA反义链主要代谢途径为3’端失去一个核苷酸，形成主要代谢物AS(N-1)3'；正义链主要代谢途径为失去1~3个GalNAc分子。通常AS(N-1)3'是主要的活性代谢物。在临床前和临床阶段，当活性代谢物比例超过10%时，研发者对活性代谢物进行了较为全面的药动学研究（如Givosiran）。
c. GalNAc-siRNA中AS链和SS链血浆/血清稳定性分析
如表7和表8所示，在各个种属间GalNAc-siRNA其体外血清和体内血浆稳定性结果相似，都较为稳定，且SS链在血浆中相较于AS链更稳定。这可能是由于SS链3'端连接有GalNAc基团，在一定程度上保护SS链3'端免受核酸外切酶代谢[13]。同时SS链3'端GalNAc基团的存在使得AS链5'端空间位阻较大，这可能是GalNAc-siRNA更倾向于形成AS(N-1)3'而不是AS(N-1)5'的原因。
表8. 上市siRNA药物体内代谢数据a
a. 表格数据为各上市药物FDA/EMA资料总结。
b. AS (N-1)3' lumasiran血浆中比例不多于10%。猴肝脏中检测到3'端脱氨基代谢物。
c. 给药后15天，Vutrisiran原型药仍然是大鼠和猴肝脏中主要的药物相关物质。
d. 申报资料中描述，人血浆中检测到的游离的双链siRNA小于5%，表明siRNA仍被LNP包裹。
e. 在人血浆中，AS(N-1)3' givosiran的浓度大约是Givosiran的一半。
f. AS (N-1)3' lumasiran，其在血浆中的比例不到Lumasiran的10%。
四、上市siRNA药物的排泄
由于寡核苷酸药物极性、亲水性以及自身所带负电荷，寡核苷酸药物主要通过尿液排泄。无论是GalNAc-siRNA还是LNP-siRNA，其血液循环中主要消除途径是经肝脏迅速摄取后代谢，次要清除途径是通过肾脏清除。
a. 上市siRNA药物的排泄研究数据总结及分析
如表9和表10所示，上市的5个siRNA药物主要通过同位素标记和未标记化合物的物质平衡研究考察其自身排泄，Patisiran额外考察了两个新型脂质分子的排泄。从大鼠放射性数据来看（表9），正常大鼠中尿液放射性占比19.5%到57.8%，粪便放射性占比14.3%~33.9%，胆管插管大鼠中胆汁放射性占比20%~28.3%，尿液和胆汁是主要的排泄途径。食蟹猴物质平衡研究中，尿液放射性占比32%到50%，粪便中放射性占比1.6%~10%，与大鼠一致，尿液是siRNA的主要排泄途径。
表9. 上市siRNA药物物质平衡实验数据（Hot）a
a. Hot指同位素标记的化合物。此表中数据均来源于Hot化合物给药后的排泄数据。表格数据为各上市药物FDA/EMA资料总结。“NA”表示没有相关数据。
b. 胆管插管大鼠的尿液或粪便排泄数据。勘误：胆汁数据应归属大鼠
由临床前数据可知，siRNA代谢途径清晰且其在肝脏有着长的消除半衰期。因此，出于安全性的考量，上市siRNA药物均没有进行同位素标记的人体物质平衡研究。如表10所示，14%~25.8%的GalNAc-siRNA原型药在人体内通过尿液排出体外，其中大部分在给药后24小时内通过尿液排泄，表明大部分药物被肝脏迅速吸收；大鼠和猴中，小于24%的原型药通过尿液排泄。临床数据与临床前数据较为吻合，siRNA药物在人体内主要消除途径为肝脏摄取，其次为肾脏清除。
表10. 上市siRNA药物物质平衡实验数据（Cold）a
a. Cold指未进行同位素标记的化合物。此表中数据均来源于Cold化合物给药后的排泄数据。表格数据为各上市药物FDA/EMA资料总结。“-”表示没有检测到，“NA”表示没有相关数据。
b. 上市siRNA药物对肾损人群的考量
在上市的5个siRNA药物中，仅Inclisiran对肾损患者进行了特定的临床PK研究，其余4个siRNA药物均是仅在群体药动学研究中评估了轻度或中度肾损对药物浓度和药效的影响[20]。结果表明，尽管肾损患者血浆Cmax和AUC有所提高，但并没有影响到siRNA药物药效。轻度或中度肾损患者没有进行剂量调整。
五、上市siRNA药物药物相互作用
尽管预期寡核苷酸药物不是CYP450酶以及转运体的底物，但理论上，寡核苷酸也可以通过影响调控途径来影响酶和转运体的表达，例如寡核苷酸靶向的mRNA可能涉及到CYP酶形成的转录翻译上游过程，从而影响CYP酶的表达。
如表11所示，列举了上市siRNA药物的DDI测试类型及结果。除Givosiran外，上市siRNA药物都不对CYP酶产生抑制，也不是转运体的底物和抑制剂。尽管Givosiran的体外DDI结果显示[13]，其对P-gp有一定的抑制作用，但在临床相关剂量下，其对P-gp产生抑制的可能性很小。此外，Givosiran有可能影响肝脏中血红素依赖性生物过程，例如CYP酶功能。对此，Givosiran开展了一项专门的临床DDI研究，结果显示有一定的临床DDI风险。
总的来说，缺乏寡核苷酸药物相关的DDI指导原则，更为提倡像小分子药物一样，尽可能多的评估其DDI。
表11.上市siRNA药物DDI测试及结果*
*: No: 没有相关活性；Not evaluated: 没有进行相关测试。表格数据为各上市药物FDA/EMA资料总结。
结语
本文主要概述了五款上市siRNA药物的临床前药代动力学实验设计及数据总结，从DMPK的角度为读者提供详实的数据材料及实验设计素材，帮助相关领域药物研发工作者了解siRNA临床前研究的实验类型。药明康德DMPK建立了寡核苷酸药物药代动力学研究方法策略及相应的体内外一体化测试平台，期待助力客户快速推进寡核苷酸新药研发项目。
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参考文献:
[1] Chris MacLauchlin, A. The ADME of siRNA GalNAc conjugates 2020. 16th Oligonucleotide Ther. Soc. (2020).
[2] Chen, S. et al. Development of lipid nanoparticle formulations of siRNA for hepatocyte gene silencing following subcutaneous administration. J. Control. Release 196, 106–112 (2014).
[3] Mihaila, R. et al. Mathematical Modeling: A Tool for Optimization of Lipid Nanoparticle-Mediated Delivery of siRNA. Mol. Ther. - Nucleic Acids 7, 246–255 (2017).
[4] Witzigmann, D. et al. Variable asialoglycoprotein receptor 1 expression in liver disease: Implications for therapeutic intervention. Hepatol. Res. 46, 686–696 (2016).
[5] Springer, A. D. & Dowdy, S. F. GalNAc-siRNA Conjugates: Leading the Way for Delivery of RNAi Therapeutics. Nucleic Acid Ther. 28, 109–118 (2018).
[6] European Medicines Agency. European Public Assessment Report: Onpattro (patisiran). 44, (2018).
[7] Nick Kozauer, MD（Alnylam Pharmaceuticals, I. . Cross-Discipline Team Leader Review. Patisiran NDA (2016).
[8] Alnylam. Givosiran NDA MULTI-DISCIPLINE REVIEW.
[9] European Medicines Agency (EMA)/Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP). Assessment report for Oxlumo. vol. 31 (2020).
[10] Kallend, D., Stoekenbroek, R., He, Y. L., Smith, P. F. & Wijngaard, P. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of inclisiran, a small interfering RNA therapy, in patients with hepatic impairment. J. Clin. Lipidol. 16, 208–219 (2022).
[11] Habtemariam, B. A. et al. Single-Dose Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Transthyretin Targeting N-acetylgalactosamine–Small Interfering Ribonucleic Acid Conjugate, Vutrisiran, in Healthy Subjects. Clin. Pharmacol. Ther. 109, 372–382 (2021).
[12] European Medicines Agency (EMA)/Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP). Assessment Report of Givlaari (givorisan). Assess. Rep. - Givlaari 31, (2020).
[13] Li, J. et al. Nonclinical pharmacokinetics and absorption, distribution, metabolism, and excretion of givosiran, the first approved n-acetylgalactosamine-conjugated rna interference therapeutic. Drug Metab. Dispos. 49, 572–580 (2021).
[14] Fda. Lumasiran NDA.
[15] McDougall, R. et al. The Nonclinical Disposition and Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Properties of N-Acetylgalactosamine-Conjugated Small Interfering RNA Are Highly Predictable and Build Confidence in Translation to Human. Drug Metab. Dispos. 50, 781–797 (2022).
[16] https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/leqvio-epar-public-assessment-report_en.pdf. https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/leqvio-epar-public-assessment-report_en.pdf (2020) doi:10.1358/dof.2017.042.06.2623106.
[17] Fda. Vutrisiran non-clinical review. (2022).
[18] Andersson, P. & Den Besten, C. CHAPTER 20: Preclinical and Clinical Drug-metabolism, Pharmacokinetics and Safety of Therapeutic Oligonucleotides. RSC Drug Discov. Ser. 2019-January, 474–531 (2019).
[19] McDougall, R. et al. The Nonclinical Disposition and PK/PD Properties of GalNAc-conjugated siRNA Are Highly Predictable and Build Confidence in Translation to Man. Drug Metab. Dispos. DMD-MR-2021-000428 (2021) doi:10.1124/dmd.121.000428.
[20] Jing, X., Arya, V., Reynolds, K. S. & Rogers, H. Clinical Pharmacology of RNAi-based Therapeutics: A Summary Based On FDA-Approved Small-interfering RNAs. Drug Metab. Dispos. DMD-MR-2022-001107 (2022) doi:10.1124/dmd.122.001107.
作者：潘岩，袁佳琪，马利萍，金晶
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