液相色谱-荧光检测方法在寡核苷酸DMPK定量生物分析中的应用

寡核苷酸的靶点和作用机理的差异化，化学修饰和递送系统的多元化导致其生物分析的方法面临许多挑战，往往需要根据待测寡核苷酸的结构，递送系统以及检测所需要的灵敏度选择适当的生物分析平台。定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）和杂交ELISA方法具有较高的灵敏度，但特异性较低；基于液相-质谱联用（Liquid chromatography–mass spectrometry, LC-MS）的方法可以提供较高的特异性但在生物样品分析中灵敏度一般只有5-10 ng/mL，基于杂交的液相-荧光检测（Hybridization based LC–fluorescence assay，LC-FL）方法检测寡核苷酸既具有较高的灵敏度又具有较好的特异性，被广泛的用于临床前和临床药代动力学生物样品中寡核苷酸的定量分析。本文将介绍LC-FL方法的原理，优点及挑战和解决方法，基于部门经验与研究案例分享一些见解。

一、基于杂交的液相-荧光检测方法原理

基于杂交的液相-荧光检测（Hybridization based LC–Fluorescence assay，LC-FL）方法是探针杂交和液相-荧光联用分析的结合。利用LC-FL进行寡核苷酸定量分析，主要包含了三个步骤:

• 荧光标记的肽核酸（Peptide nucleic acids，PNA）探针通过Watson-Crick碱基配对结合到待测的寡核苷酸形成荧光标记复合物；

• 通过离子交换液相分离荧光标记复合物与过量的PNA探针；

• 利用荧光检测器检测荧光标记复合物。

图1. LC-FL分析方法原理图

PNA是一种以多肽骨架取代磷酸主链的DNA类似物，见图2。由于PNA不包含带电的磷酸基团，因此呈电中性，与目标DNA或RNA互补杂交，具有很高亲和力和特异性。PNA在体内和体外都非常稳定,对核酸酶和蛋白酶具有抗性^[1]。独特的物理化学性质使PNA广泛的被应用于核酸序列测定、基因检测以及疾病诊断。

图2. PNA和DNA结构对比^[1]

ATTO荧光染料通常是香豆素类，罗丹明，嗪等的衍生物，水溶性较高，其波谱涵盖了从紫外光到近红外光范围，是最全波段的荧光标记。

在加入PNA荧光探针前，生物样品先用蛋白酶K消化，去除大部分基质蛋白，将其中待测的寡核苷酸与ATTO荧光染料标记的PNA探针结合形成荧光标记复合物，利用交换色谱将过量的PNA荧光探针与寡核苷酸荧光标记复合物样品进行分离，通过调节洗脱液pH、盐和溶剂来选择性控制对寡核苷酸及其代谢产物分辨，及分辨具有二级结构的寡核苷酸。荧光染料在吸收某一波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光的光波，而荧光检测器通过检测发射波的能量即可定量。

二、基于杂交原理的液相-荧光检测方法的优点

1. 检测灵敏度高，可用于临床前及临床样品分析

与基于杂交原理的ELISA方法类似，基于杂交原理的LC-FL方法可以轻松实现1 ng/mL 或更低的检测下限，且样品前处理中不涉及提取步骤就可以对血浆或组织匀浆中的寡核苷酸进行定量分析^[2]。荧光检测器响应稳定,具有较高的准确性和精确性，相比于ELISA方法有更宽的线性范围。目前已上市的寡核苷酸类药物，如Patisiran即使用LC-FL方法检测临床前及临床样品中Patisiran的浓度，用于PK分析^[3]。

2. 良好的选择性，可用于代谢产物定量分析

基于杂交原理的LC-FL方法可以避免生物样品中未被荧光标记的其他成分的干扰，具有良好的选择性。此外，依托高效液相色谱可以用于寡核苷酸代谢产物的定量分析。一些被截短的寡核苷酸代谢物（n-1，n-2等）可以有效地与荧光标记的PNA探针杂交，并通过离子交换色谱对待测寡核苷酸及其截短的代谢物（n-1，n-2等）进行分离。

3. 不受寡核苷酸结构修饰及递送系统的影响

相比较于qPCR方法，基于杂交原理的LC-FL方法对寡核苷酸化学修饰有较好的包容性，其检测灵敏度和特异性不受影响。该分析方法可用于GalNAc偶联寡核苷酸，LNP递送寡核苷酸，及其他递送系统的寡核苷酸在临床前及临床研究中生物样品的检测。

三、基于杂交原理的液相-荧光检测方法的挑战

1. 探针的设计和筛选

开发基于杂交原理的LC-FL方法主要的挑战来自于探针的设计和筛选，探针对检测的灵敏度和特异性至关重要，且需要在方法开发过程中逐步进行优化和筛选，所以PNA探针的设计和筛选会是LC-FL方法中成本和耗时的关键因素。PNA探针需要与待检测的寡核苷酸序列互补配对，其序列长度为12-21个碱基。因为PNA/PNA相互作用比PNA/RNA相互作用更强，有更高的亲和力，所以会影响荧光标记复合物的形成，在探针设计过程中应避免任何自互补序列，例如反向重复、发夹形成和回文序列。此外还应避免富含嘌呤的序列，因为嘌呤含量影响PNA探针在水溶液中的溶解度，所以尽量限制嘌呤含量，且避免嘌呤延伸。为了提高PNA探针的溶解度，还可以添加溶解度增强剂，例如O linker、E linker、X linker或氨基酸等等。

2. 代谢产物定量分析

由于LC-FL方法是通过离子交换色谱对待测寡核苷酸及其截短的代谢物（n-1，n-2等）进行分离，因此需要代谢产物标准品来确认代谢物的保留时间。对于双链的siRNA，由于PNA探针一次只能检测双链中的一条链，因此siRNA中的正义链和反义链的代谢产物只能分别检测。此外由于每个P=S键修饰会引入手性中心，使硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸及其代谢物的色谱分离更加困难^[4]。

柱温和流动相条件对方法的灵敏度和特异性也同样很重要，因此需要针对每个特定探针和/或待测寡核苷酸进行优化。LC-FL方法通常用于支持后期临床前或临床研究，而LC-MS/MS或LC-HRAM-MS检测更常用于药物发现或早期开发阶段，欢迎阅读我们的已发布文章：“质的飞跃”液相色谱-质谱联用在寡核苷酸药代动力学定量分析中的应用。

四、利用LC-FL方法定量分析GalNAc-siRNA偶联寡核苷酸案列分享

基于杂交的LC-FL方法具有高灵敏度、高准确度和精密度的定量性能，我们开发了基于杂交的LC-FL方法对GalNAc-siRNA偶联寡核苷酸进行定量分析, 并对方法的特异性, 选择性, 灵敏度, 线性范围和准确度进行方法学验证。该方法采用ATTO425标记的PNA荧光探针与GalNAc-siRNA双链体中的反义链（Antisense strand，AS）互补杂交，检测反义链的浓度，GalNAc-siRNA的浓度将根据反义链的浓度进行报告。

01 标准曲线与定量范围

图3展示了样品处理后加标大鼠血浆样品的定量性能，LLOQ低至1 ng/mL，线性范围在1-200 ng/mL之间。

图3. LLOQ（1 ng/mL）和对照空白样品的

代表性色谱图

图4. 与PNA荧光探针杂交的

GalNAc-siRNA在大鼠血浆中的校准曲线

（1-200 ng/mL；Linear 1/X²，R²=0.99）

02 准确度和精密度

质控样品的批内准确度范围为90.2%至119.7%，批间准确度范围为97.4.6%至105.5%；批内精密度%RSD范围为2.1%至20.0%，批间精密度%RSD从7.7%到19.5%。该数据满足监管机构对于准确度（±20%）和精密度（±20%）的法规要求。

03 代谢产物分离

由于生物样品的体积非常有限，利用离子交换高效液相色谱和荧光检测的方法，同时对待测寡核苷酸及其反义链代谢物3’n-1 和3’n-2进行分离，在确保检测灵敏度的前提下，分离效果良好。

图5展示了离子交换高效液相色谱分离待测寡核苷酸及其反义链代谢物3’n-1 和3’n-2。

图5. 利用离子交换高效液相

色谱分离GalNAc-siRNA及其代谢产物

结语

基于杂交的液相-荧光检测（Hybridization based LC–fluorescence assay，LC-FL）方法检测寡核苷酸既具有较高的灵敏度又具有较好的特异性，被广泛的用于临床前和临床代动力学生物样品中寡核苷酸的定量分析。

药明康德药性评价部Non-GLP生物分析团队具备全面的寡核苷酸药物生物分析能力，开发并建立了包括：液相色谱-三重四极杆质谱联用（LC-MS/MS），液相色谱-高分辨质谱联用（LC-HRMS），基于杂交的液相-荧光检测（LC-FL），配体结合检测（LBA），和定量聚合酶链反应（qPCR）5大生物分析平台，支持从早期药物筛选到IND申报的寡核苷酸生物分析，提供多样化的生物分析平台，具有丰富的寡核苷酸生物方法开发经验，可以实现高质量的体内外数据交付，加速药物研发进程。

图6. 药明康德DMPK寡核苷酸生物分析平台

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。 

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作者：刘思宇，章何峰，王洪梅，赵楠，邢丽丽

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟