整合性生物分析在抗体偶联药物（ADC）DMPK研究中的应用

与其他的治疗手段类似，抗体偶联药物（Antibody-drug conjugate, ADC）是一种新兴的靶向和杀伤癌细胞的治疗方式。能有效地杀伤肿瘤细胞，是十分高效的靶向治疗工具。自2000年第一款ADC获批以来，美国FDA已经获批了14种ADC药物，主要用于对抗血液癌、乳腺癌、尿道癌和宫颈癌的治疗。

ADC药物结构通常包括靶向肿瘤细胞表面抗原的单克隆抗体（antibody）、具有细胞毒性的载荷小分子（payload）以及连接子（linker）组成，ADC药物结构的复杂性增加了其在药物研究过程中的难度。对ADC各组分的定量检测对理解ADC药物的稳定性以及潜在毒性至关重要。

图1. ADC药物的结构组成

ADC药物的代谢和药物动力学（drug metabolism and pharmacokinetic, DMPK) 研究贯穿ADC药物早期发现/筛选、临床前和临床的各个阶段，在不同阶段有着不同的研究侧重点。各个阶段通常都包括总抗体（total antibody）、偶联抗体 (conjugated antibody，ADC)、游离载荷（free payload）和可能的代谢物的定量分析。在药物筛选阶段，通常会增加体外稳定性，药物载荷比（drug-antibody ratio，DAR）和体外生物转化鉴定等；而在临床前和临床阶段评估中，通常会包括免疫原性评估等。在ADC药物的不同研发阶段，生物分析对于帮助药物研发者了解其特性是必不可少的，分析ADC药物通常都需要多种分析平台的协作，结合经典的小分子/大分子以及融合性的分析手段，这就提出了整合性生物分析的概念。本文将详细介绍ADC药物研究中涉及的生物分析平台，并为药物研发者提供建议。

一、ADC药物研究简介

为ADC药物选择合适的生物分析研究策略的基础是了解其药物结构。ADC药物的连接子（linker）可分为可裂解型或不可裂解型。可裂解的连接子遇到溶酶体酶、酸性、还原性等特定条件时断裂，此时ADC药物的载荷将会释放。载荷的释放使得癌细胞被杀死，被杀死的癌细胞又重新释放载荷杀伤周围癌细胞（旁观者效应）。不可裂解型的连接子是通过降解抗体来释放其载荷，这部分释放的载荷将会有部分肽链或氨基酸的结合。无论ADC药物的连接子是可裂解还是不可裂解的，研究人员都需要了解ADC药物的抗体部分生物学机制（包含结合配体的生物学机制，结合Fc受体机制等），载荷的释放过程以及载荷代谢相关的成分（payload related species）。靶器官中的载荷释放量决定了ADC药物的药效，而非靶组织中的载荷释放量决定了其毒性。

图2. ADC药物常见作用机理示意图^[1]

DAR值的确定以及动态监测是ADC药物研究中的另一关键。DAR指的是ADC药物中每个抗体偶联的载荷数量，是描述ADC药物的安全性和有效性等生理化学性质的重要参数。对于FDA批准的ADC药物，DAR通常为3-4，这表明单个抗体偶联着三个或四个载荷。而过高的DAR将会导致药物的清除率增加，半衰期降低，药物的聚集加剧以及药物毒性增加，通常由于载荷的强疏水性导致。但是，ADC药物的高DAR并不意味着其药效不好或者毒性，DS8201就是一个很好的例子。合适的载荷的选择以及连接子的设计也能使得高的DAR得以充分的发挥作用来产生良好的抗肿瘤功效。

ADC药物研究通常需要整合小分子和大分子的研究策略，不同策略都能提供独特的信息。例如，基于高分辨质谱的代谢产物鉴定研究可以帮助了解药物代谢的情况，帮助判断潜在的载荷代谢物，小分子分析平台LC/MS (Liquid Chromatography–Mass Spectrometry)可以帮助定量ADC药物释放的载荷或载荷相关的代谢物。ADC药物总抗体部分或者偶联抗体的定量分析通常使用大分子分析平台LBA (Ligand Binding Assay)完成。而ADC药物的DAR评估以及ADC整体的稳定性评估则需依赖两个平台的融合，我们又称融合LBA-LC/MS平台，不同策略的结合帮助药物研发者了解ADC药物的代谢特征，以及与药物的药效和毒性之间的关系。

表1. ADC各成分与其对应的分析方法

值得注意的是，肿瘤表达的抗原出现在正常组织中（即不在肿瘤细胞中）的情况可能导致ADC药物产生脱靶毒性。为了避免这种情况，一些药物研发者使用抗体前药（antibody prodrug）的策略，使抗体药物在循环系统中保持无活性的状态，直到它到达肿瘤微环境。尽管前药策略有着显著优势，但也给生物分析带来了新的挑战。前药的设计使ADC药物的结构更复杂化，增加了体内ADC的分子种类（molecular species）。另外，为了解ADC前药的结构设计是否符合预期，同时监测ADC前药的活性与非活性形式也十分必要。

ADC前药分子种类的复杂性给生物分析方法提出了更大的挑战。在这种情况下，使用基于LC/MS的特征肽定量方法（LC/MS-based surrogate peptide）可能效果更好，有助于药物研发者了解ADC前药的设计是否符合预期，其大致过程是：ADC前药被富集，然后被酶解成更小的肽段，对来自ADC不同区域的特征肽进行定量，并推测其结构信息。选择合适的特征肽对于定量的准确性、灵敏度、特异性和稳健性至关重要。

图3. 基于LC/MS的特征肽段分析示意图

二、ADC药物生物分析整合性平台

各个实验室用于研究ADC药物的常见生物分析平台都基本相同。其中，配体结合分析（LBA）、三重四极杆液相串联质谱、高分辨液相串联质谱LC/HRMS (Liquid Chromatography–High Resolution Mass Spectrometry)平台、以及融合LBA-LC/(HR)MS平台广泛应用于研究ADC药物的暴露-反应（exposure-response）关系。在实际研发过程中，ADC药物的研究依赖这些实验平台的整合。以下列出的每种平台在ADC药物的生物分析中都有明显的优势和劣势。

配体结合分析（Ligand-binding assays, LBA）

LBA方法是最常用的定量ADC药物中的抗体部分的策略，包括定量总抗体（total antibody）和偶联抗体（conjugated antibody）。该平台在相对较低的实验和仪器成本下具有灵敏度高，通量高且稳定的特点，并且可供参考的相应法规体系很完整。LBA可以通过设计特定的检测形式（assay format），满足不同的检测需求。

图4. 总抗体和偶联抗体常见ELISA检测形式

LBA平台在ADC药物的生物分析中仍具有局限性。例如LBA无法提供DAR的相关信息，而且对ADC药物的生物转化不敏感。另外，LBA的特异性和灵敏度十分依赖于关键试剂的选择。但LBA关键试剂的制备可能既昂贵又耗时，尤其是抗载荷抗体（anti-payload antibodies）的制备。LBA平台在ADC药物的生物分析中最大的劣势可能是基本无法获得有关ADC药物的结构信息以及可能的生物转化的信息。关于LBA平台详细策略，后续我们会发布相关文章。

三重四极杆液相串联质谱（Triple quadrupole based LC/MS）

这里指的是工业界最常用的基于三重四极杆的低分辨LC/MS平台，其作为一种用于定性和定量分析的强大方法，在过去20年里彻底改变了小分子药物的研发。其应用非常广泛，目前是小分子和多肽生物分析的“黄金标准”，具有优异选择性和灵敏度的SRM/MRM (Selected Reaction Monitoring/Multiple Reaction Monitoring)分析模式以及多离子通道的分析功能都是其巨大的优势。LC/MS方法可以高效的定量ADC药物在体内/体外实验中的游离载荷，载荷相关代谢物以及抗体特征肽段等。而大分子因分子量较大、电离困难、结构复杂和异质性强的特点在使用该平台检测时具有挑战。关于使用LC-MS平台研究ADC药物的详细策略，欢迎参考：基于LC-MS技术的抗体偶联药物（ADC）药代动力学生物分析策略。

高分辨液相串联质谱（high-resolution mass spectrometry, LC/HRMS）

LC/HRMS平台通常指有更高分辨率的LC/MS平台，常见有基于Orbitrap或者飞行时间（time-of-flight, TOF）检测器的质谱平台。其基于MS²至MSⁿ的多级碎裂功能以及准确的碎片离子m/z质荷比的测定，在已有数据库或者de-novo sequencing软件的帮助下可以有效的识别抗体，肽段或者小分子部分的相关结构和序列。LC/HRMS方法因能准确测量化合物的质量，所以表现出了极高的选择性。当研究ADC小分子部分生物转化时，该平台经常被用于代谢产物的鉴定。

融合 LBA-LC/MS（Hybrid LBA-(HR)LC/MS）

LBA-(HR)LC/MS一定程度上被认为是分析大分子（LBA）和小分子（LC/MS）的两种金标准平台的融合。先用LBA技术亲和捕获或富集目标分析物（ADC），随后通过液相色谱将复杂的混合物分离，最后用质谱定性和定量检测不同的分子物种，解析其结构或者研究其生物转化等。富集后的ADC，可以进行酶解定量检测特征肽；也可以通过完整蛋白分析的方式进行定量检测。

该平台的优势在于在定性/定量分析同时获取丰富的ADC药物结构相关信息，包括对DAR的动态评估，药物的生物转化以及对多种分子物种的同时监测等。但与其他平台相比，此方法的灵敏度和稳定性有待提高。尽管LBA-LC/(HR)MS有其明显的优势，但是依然有一些缺点，例如开发LBA-LC/(HR)MS方法通常更昂贵，它需要复杂的设备，也需要训练有素的药物研发者广泛合作。不仅如此，数据处理的不同（特别是数据解卷积算法，data deconvolution algorism）也会影响分析计算的结果。最后，关于这类平台方法开发与验证的可参考的监管指导原则非常少。

分析平台的选择取决于研究目的。比如说，LBA平台通常是ADC抗体部分分析的首选。但如果目的是进行ADC的DAR值评估或了解抗体的生物转化情况，即研究载荷是否被切割以及在何位置被切割，融合LBA-LC/MS或LC/HRMS将是更好的选择。而对于游离载荷或者已知的主要载荷代谢产物的分析，传统LC/MS平台则可以完全胜任。

表2. ADC药物各生物分析平台适合的分析内容

对于ADC的生物分析，如上平台间不是独立的，特定检测需求往往需要多平台的协作。这里举个例子可以更好阐述多分析平台之间的协同。假设我们需要对一个ADC进行血浆体外稳定性考察，我们需要使用LC/HRMS平台分析其潜在载荷相关代谢产物，利用LC/MS平台定量/半定量检测游离载荷以及主要载荷代谢产物。利用LBA平台进行总抗体/偶联抗体的定量，以及利用融合LBA-LC/(HR)MS平台进行对ADC药物DAR值动态评估以及获得ADC整体的生物转化信息。这就提出了ADC整合性生物分析的概念，通过多分析平台及不同学科背景的药物研发者的协作，建立合适的分析方案，帮助阐明特定的ADC药物研发问题。

三、对ADC药物生物分析的建议

ADC药物的研究中，确定研究目标的优先级对于项目的进展至关重要。在早期发现阶段，ADC药物药效是主要关注点，同时药物的DMPK特征也很重要。ADC药物的分析需要评估候选药物的稳定性以及生物转化过程，即了解载荷如何从抗体中释放，并在杀死癌细胞的同时不达到危险的系统暴露水平。DMPK研究可以阐明ADC药物的疗效和潜在毒性之间的联系，这有助于药物研发者选择合适的连接子和载荷以及更好地设计抗体部分。对于候选ADC药物的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）特性的研究，再结合体内PK分析的数据，将决定该药物是否可能成为有效的治疗药物。

目前整合性生物分析是研究ADC药物最有效的手段，这将为ADC药物研究提供丰富且有价值的数据。例如ADC药物在体外血浆中的稳定性提示了它在循环系统中相似的稳定性，这一实验结果可以为ADC药物的安全性评估（即毒理学研究）提供关键支持，并帮助药物进一步走向临床试验。以上的研究结果极大地影响着ADC药物的命运，决定了该药物应该继续向前推进或者及时终止。这些研究应该在早期研究阶段开展，如果在没有充分了解其稳定性的情况下进行药物IND提交，可能导致时间和资源的浪费。 

尽管业界ADC药物研发进展的如火如荼，但总体而言ADC药物依然是十分新兴的领域。从监管的角度来看，相关的指南和法规还处在正在成型阶段。例如，基于完整蛋白的ADC生物分析方法相对较新，基本没有相关分析方法建立或验证的法规指导。其分析需使用几种高度复杂的算法来分析数据，不同算法都有自己的特定设置，使用不匹配的算法和设置会影响数据的可靠性。 

监管机构通常只要求在提交IND DMPK报告时提供ADC药物的总抗体、偶联抗体以及游离小分子化合物（载荷以及主要载荷代谢产物）的PK数据。虽然DAR值动态评估以及生物转化研究能提供的额外数据将帮助药物研发者筛选出最有希望的候选药物，但是目前监管机构并不要求这些数据。但未来这种情况会随着对ADC药物理解的更深入而改变。

参考《抗体偶联药物非临床研究技术指导原则-（征求意见稿）》，ADC药物临床前药代动力学研究建议包括如下。

表3. ADC药物临床前药代动力学研究建议开展项目

结语

ADC药物作为高效的癌症治疗药物，其巨大的潜力使得药物研发者倍感振奋。鉴于ADC药物复杂的结构，其稳定性、有效性和安全性的相关研究需要整合性生物分析平台来确保获得准确且丰富的数据。考虑到ADC药物间的不同，高效的ADC药物的生物分析需要制定合适的整合性分析策略。如下一些具体的问题可以帮助ADC药物的生物分析策略的制定。比如：

• 载荷偶联在半胱氨酸，赖氨酸或其他部位？

• 载荷是否是定点偶联？

• 连接子是可裂解的还是不可裂解的？

• 是否有抗载荷抗体（anti-payload antibody）？

• 载荷或者连接子是否全新，或是已被透彻研究过？

这些问题将帮助制定合适的整合性分析策略。高效的分析方法开发将更多地依赖于研究者的技能、知识和专长。ADC药物的研发者如果缺乏足够的时间、相关的能力或专业知识，可以考虑与具有丰富经验的测试伙伴合作。

药明康德DMPK具备丰富的临床前生物分析经验，目前在ADC药物的生物分析上，已承接几十个项目，包含数十个IND项目。可以帮助客户快速完成临床前生物分析方法的建立和验证，满足药代动力学的FDA/NMPA/TGA的IND申报要求。目前建立的ADC药物的整合性生物分析平台可以帮助ADC药物开发者在不同的研究阶段更加高效/准确的评估ADC药物体内/体外的ADME特征，更好的理解其药效与安全性之间的关系，为后续的安全性评价和临床研究打下坚实的基础。

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。 

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作者：周毛天，颜欢，邢丽丽

编辑：方健，钱卉娟，李陟昱

设计：倪德伟