解读 │ FDA 批准的反义寡核苷酸药物的吸收、分布、代谢和排泄特征

在美国康涅狄格大学的研究人员于药物代谢领域的著名期刊Drug Metabolism and Disposition上发表的题为《Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion of FDA approved Antisense Oligonucleotide Drugs》的综述^[1]中，他们选择了已被FDA批准的10种反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotide，ASO）药物，Fomivirsen、Pegaptanib、Mipomersen、Nusinersen、Inotersen、Defibrotide、Eteplirsen、Golodirsen、Viltolarsen和Casimersen，通过集合分析，总结了ASO的主要ADME特征，也提出了当前的知识缺口与未来的研究展望。本文我们将为读者解读其中的部分精彩内容以及分享一些我们的看法。

一、反义寡核苷酸药物背景介绍

吸收、分布、代谢和排泄（ADME）是决定药代动力学参数的关键生物学过程，这些过程能直接影响药物的疗效和不良反应。化学结构、剂型、给药部位和给药途径是影响ADME特征，进而影响疗效和不良反应的主要决定因素。近年来，反义寡核苷酸（ASO）药物的开发步伐明显加快。ASO是合成的单链反义寡核苷酸，对于某些疾病的治疗具有巨大的潜力。它们具有完全独特的ADME特征，且与小分子化学药物存在实质性差异，了解它们的ADME特征对于开发疗效和安全性更优的ASO新药至关重要。

ASO药物的开发最早可追溯到1978年，人们首次发现一种寡核苷酸能够抑制Rous肉瘤病毒RNA的翻译。经过行业近20年的努力，FDA于1998年批准了第一个ASO药物Fomivirsen，用于治疗巨细胞病毒（CMV）视网膜炎（图1）。经过多年的发展低谷，自2013年起FDA接连批准了8个ASO药物。最近几年，ASO药物发现和开发平台得到了进一步完善，目前已有超过100种ASO药物入组各期临床试验。

图1. FDA 批准的10种ASO药物^[1]

根据作用机理，这10种药物可分为5组。

A 诱导核糖核酸酶H介导的mRNA降解：Fomivirsen、Mipomersen和Inotersen。

B 诱导外显子跳跃：Eteplirsen、Golodirsen、Viltolarsen和Casimersen。

C Nusinersen起外显子修复的作用。

D Pegaptanib是一种核酸适配体，可与血管内皮生长因子受体发挥相互作用。

E Defibrotide是各种单链寡核苷酸颗粒的多分散混合物，它靶向多个靶点，通过拮抗机制治疗静脉闭塞性疾病（VOD）。

根据给药途径，它们可分为4组（图2）。

A 玻璃体腔注射：Fomivirsen和Pegaptanib，分别用于治疗眼部CMV视网膜炎和眼后部新生血管性黄斑变性。

B 鞘内注射：Nusinersen，用于治疗脊髓性肌萎缩。

C 皮下注射（SC）：Mipomersen和Inotersen，分别用于治疗家族性高胆固醇血症，和淀粉样变性多发性神经病，每周给药一次。

D 静脉输液（IV）：Defibrotide、Eteplirsen、Golodirsen、Viltolarsen和Casimersen。其中Defibrotide用于治疗肝小静脉闭塞，每6小时静脉输液2小时。其余4个药均被用于治疗杜氏肌营养不良（DMD），每周输液一次。

图2. ASO 药物的给药途径和剂型^[1]

小分子药物与ASO药物的ADME差异原因：

小分子药物的ADME由I相和II相药物代谢酶、摄取和外排转运蛋白、转录因子和核受体所介导（图3A），而ASO的ADME由完全不同的途径决定（图3B）：ASO进入靶细胞主要是通过内吞进入初级内体（EE），然后通过亚细胞载体在胞内进行移动。ASO的代谢主要由核酸外切酶和内切酶催化，产生链缩短的寡核苷酸，然后通过膜渗漏、囊泡或外泌体释放至尿路排出。这些特征决定了ASO药物在循环系统中的半衰期和给药频率。

图3. 小分子药物和ASO药物的ADME过程比较

(A) 口服小分子药物的ADME; (B) ASO药物的ADME^[1]

二、FDA批准ASO药物的ADME特征

吸收 

这些ASO药物具有多种吸收模式，与治疗的疾病、给药方式等相关（表1）。

Fomivirsen和Pegaptanib用于治疗眼部疾病，药物在眼内局部注射给药。在兔体内，Fomivirsen注射数小时内可在视网膜中检测到，3至5天后浓度仍在增加。玻璃体内给药剂量较低，且在眼内分布缓慢，因此药物的全身暴露量很少。同样，Pegaptanib在兔眼中的浓度最高，从眼部缓慢吸收后进入体循环，最后经肾脏排泄。Nusinersen是通过鞘内注射的，可以绕过血脑屏障到达中枢神经系统。与脑脊液浓度相比，血药浓度较低。其余几个ASO药物主要经全身吸收，影响到体内一系列的器官。

• 点评：与小分子药物主要经口服给药后吸收不同，ASO药物多数需要SC或IV给药，且IV给药后主要分布在肝、肾等组织，其他组织的摄取相对较少。将ASO有效递送到特定的组织器官是未来研发需要解决的一大挑战。目前有多种在研技术，如将ASO与脂肪酸、多肽、或N-乙酰半乳糖胺、细胞穿膜肽等进行偶联，其中部分已得到临床验证^[2]。

表1. ASO药物的吸收^[1]

分布  

血浆蛋白结合会影响药物在体内的分布。这10种ASO的血浆蛋白结合率（plasma protein binding，PPB）和生物分布都有较大的差异（表2）。Inotersen、Nusinersen、Defibrotide和Mipomersen具有较高的PPB（>90%），而Viltolarsen、Golodirsen、Casimersen、Eteplirsen的PPB较低（<40%）。Fomivirsen在兔和猴眼的玻璃体样品中结合率较低（<40%）。药物在体内的稳态分布容积代表它在体内的分布范围，对它们的稳态分布容积进行比较，从大到小排序为 Golodirsen > Eteplirsen > Casimersen、Viltolarsen、Inotersen和Nusinersen。对于药时曲线下面积（area under the curve，AUC），值得注意的是，在肾损害和终末期肾病患者中，Defibrotide的AUC值增加了50-60%。肾损害患者接受给药后，峰浓度也高出35-37%。

• 点评：硫代磷酸酯（PS）修饰的ASO（Fomivirsen、Mipomersen、Nusinersen、Inotersen），因骨架带负电荷，会与血浆中的蛋白，尤其是白蛋白高结合。Fomivirsen申报资料中未报道血浆中的PPB，我们实验室内部测试结果显示，1μM浓度下它在小鼠、大鼠、猴和人血浆中的PPB都为高结合（>99%）。结构经吗啉环（PMO）修饰的ASO（Viltolarsen、Golodirsen、Casimersen、Eteplirsen），骨架是中性的，PPB表现都较低。几种PMO-ASO有共同的特点，分布容积都比较高，说明它们在周围组织如肌肉有较高的分布。

表2. ASO药物的生物分布^[1]

*受试者间变异性。

代谢 

这10种ASO在血液和靶细胞中均有代谢，但它们不被肝脏或体外肝微粒体代谢，因此大多数与常规联合用药（易发生氧化代谢）无相互作用（Inotersen，Golodirsen，Viltolarsen，Casimersen，Nusinersen和Eteplirsen），与其他转运蛋白发生作用的可能性也很小（Golodirsen、Viltolarsen和Casimersen）。ASO主要被血液和靶器官中的核酸内切酶和核酸外切酶降解代谢，大多首先被核酸内切酶代谢，将寡核苷酸裂解成片段，然后在 3’和 5’末端进行核酸外切酶水解。为了更好的抵抗核酸酶降解，这些药物都进行了化学修饰。Fomivirsen骨架中具有硫代磷酸酯键，属于第一代寡核苷酸。Mipomersen和Inotersen含有 2'-O-甲氧基乙基核糖修饰，被视为第二代ASO，对核酸酶有更好的耐受性。尚未发现它们的代谢产物有药理学活性，或对细胞过程产生安全性问题。

• 点评：ASO分子量高，亲水性强，因此不被CYP450酶代谢是在意料之中的。另外，ASO主要经内吞过程进入细胞，并包裹在内体中，胞内游离的ASO与内质网上的CYP酶发生接触的可能性也比较小^[3-4]。

排泄 

这些ASO药物主要通过泌尿系统排泄。Fomivirsen，Eteplirsen，Golodirsen，Viltolarsen，Casimersen主要以原型药物经肾脏排泄；Nusinersen，Inotersen和Mipomersen主要以代谢物形式经肾脏排泄。这些ASO药物在体内的半衰期也表现不同。有的半衰期比较长，如Fomivirsen在人体的半衰期约为55小时，在猴体内的半衰期约为78小时。Nusinersen在脑脊液（CSF）中的半衰期为135-177天，血浆中为63-87天。Inotersen以284mg/1.5mL的剂量持续给药1周，机体总清除率和半衰期分别为3.18L/h 和32.3天。Mipomersen的半衰期为1-2个月。以10倍临床剂量经玻璃体注射后，Pegaptanib在人体的半衰期约为10天。Viltolarsen，Eteplirsen，Golodirsen，Casimersen的半衰期约为2.5-3.5小时，Defibrotide的半衰期也为数小时，这5种半衰期较短的ASO都需要以静脉输液的方式给药。

• 点评：PPB较高的ASO，能有效减少肾小球滤过，降低肾清除率，因此表现出较长的血浆半衰期。根据Mipomersen的申报资料，和人体相比，Mipomersen在小鼠中的半衰期较短，清除率较高，可能与小鼠中相对较低的PPB有关^[5-6]。经过吗啉环（PMO）结构改造后的ASO对核酸酶的稳定性非常好，如Eteplirsen和Viltolarsen，在体外与血浆或肝亚细胞组分孵育后不产生任何代谢物，所以主要以原形排泄。

三、当前的知识缺口与展望

根据这十个ASO药物的申报资料，以及相关领域的研究资料，综述认为ASO药物在细胞摄取、亚细胞转运和细胞外排方面仍存在知识缺口。

细胞摄取：

目前普遍认为存在两种相互竞争的摄取途径：将药物带入其靶标的“生产性途径”和将药物带入可饱和池的“非生产性途径”。但药物进入这两种途径的比例和其他关键决定因素是未知的。

亚细胞内的转运和分布：

小分子药物通过转运蛋白摄取或跨膜扩散，快速到达不同的亚细胞区域。而ASO通过内吞摄取进入细胞后，通常是被包裹在内体中的，然后运送至相应的靶标。核内体释放和胞内转运是ASO发挥药效的关键因素，未来需进一步明确相应的机制。另外还须了解胞内哪些位置与ASO的细胞损伤有关，以及如何避免引起蓄积。

细胞外排：

ASO被核酸酶分解后，剩余母体和链缩短的产物从细胞排出的机制是未知的。这可能影响ASO的血浆和靶标浓度。

• 点评：ASO属于一类新型分子实体，不仅人们的科学认知尚存在一些缺口，从新药注册申报的角度，也存在一些监管指南空缺。当下基于小分子研发和申报的策略，是否完全符合ASO药物？行业内是否应该更多地实施基于科学的决策？

结语

ASO药物已经发展了二十多年，但这个领域仍有许多亟待解决的问题和创新的空间，本文从DMPK的角度为读者带来一些见解，我们团队的研究人员密切关注各类寡核苷酸药物的研究动态，目前已建立评估包括反义寡核苷酸在内的多种寡核苷酸药物ADME/PK测试平台，为全球客户提供有针对性的体内外药代动力学研究服务。

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参考文献：

[1] Migliorati JM, Liu S, Liu A, Gogate A, Nair S, Bahal R, Rasmussen TP, Manautou JE, Zhong XB. Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion of US Food and Drug Administration-Approved Antisense Oligonucleotide Drugs. Drug Metab Dispos. 2022 Jun;50(6):888-897.

[2] Zanardi TA, Korbmacher B, Boone L, Engelhardt JA, Wang Y, Burel S, Prill B, Aghajan M, Guo S, Henry SP. Safety, Pharmacokinetic, and Pharmacodynamic Evaluation of a 2'-(2-Methoxyethyl)-D-ribose Antisense Oligonucleotide-Triantenarry N-Acetyl-galactosamine Conjugate that Targets the Human Transmembrane Protease Serine 6. J Pharmacol Exp Ther. 2021 Apr;377(1):51-63. 

[3]Andersson S, Antonsson M, Elebring M, Jansson-Löfmark R, Weidolf L. Drug metabolism and pharmacokinetic strategies for oligonucleotide- and mRNA-based drug development. Drug Discov Today. 2018 Oct;23(10):1733-1745.

[4] Kazmi F, Yerino P, McCoy C, et al. An assessment of the in vitro inhibition of cytochrome P450 enzymes, UDP-glucuronosyltransferases, and transporters by phosphodiester- or phosphorothioate-linked oligonucleotides. Drug Metab Dispos. 2018 Aug;46(8):1066–1074

[5] Geary RS, Baker BF, Crooke ST. Clinical and preclinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of mipomersen (Kynamro®): a second generation antisense oligonucleotide inhibitor of apolipoprotein B. Clin Pharmacokinet. 2015 Feb;54(2):133–146.

[6] Yu RZ, Kim TW, Hong A, Watanabe TA, Gaus HJ, Geary RS. Cross-species pharmacokinetic comparison from mouse to man of a second-generation antisense oligonucleotide, ISIS 301012, targeting human apolipoprotein B-100. Drug Metab Dispos. 2007 Mar;35(3):460-8. 

作者：王洁，王翔凌，陈根富

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟