药物研发中生物标志物的应用及检测技术和方式

生物标志物（Biomarker）指的是能被客观测量和评价、反映生理或致病过程、以及对医疗干预措施产生生物学效应的指标，根据其应用价值可分为诊断、监测、药效、预测、预后和风险生物标志物等几大类。从1847年首次发现蛋白质癌症标志物-尿本周蛋白开始，经过150多年的发展，人类基因组测序的完成开启了基因生物标志物的发现之旅，目前，生物标志物的发现和应用已成为生物技术及生物制药行业的重要研究方向之一。本文我们将介绍生物标志物在药物研发中的应用，并结合部门经验阐述如何检测生物标志物。

一、生物标志物在药物研发中的应用

2021年12月，CDE发布了《生物标志物在抗肿瘤药物临床研发中应用的技术指导原则》，是CDE从监管层面提出的对于药物评审的一项重大举措，表明了其对生物标志物的重视。如果在临床前的研发阶段，就针对生物标志物提出研发效果系统性的评价体系，如利用对于耐药性相关的生物标志物，药效相关的生物标志物，药物安全性相关的生物标志物等对药物进行评估，研发流程将更为透明和可控，研发的目标将更明确，药物研发后期进入临床试验阶段的成功率将有很大的提升。图1统计了2008-2010年临床二期药物研发失败及2007-2010年临床三期药物研发失败的原因，数据表明导致药物临床失败的主要原因是药物的疗效问题，占比高达50%以上。同时，经费、安全性和药代动力学都会不同程度地影响药物的研发成功率^[1]。

图1. 药物临床研发失败的影响因素^[1]

新药研发如果用在正确的病人、正确的剂量、正确的时间和正确的靶点上，对疾病的治疗将会有极大的优势。近年来，生物标志物已被用于筛选正确的靶点和正确的病人上，被公认为药物开发的有效工具^[2,3]。如图2所示，生物标志物在临床前和临床研究中的合理利用将加速药物的研发进程，包括药物作用靶标和候选药物的确认、风险评估、实验设计、剂量优化、患者分级和安全性监测等^[4]。

图2. 生物标志物在药物研发中的应用

在生物标志物的参与下，药物临床研发的成功率怎么样？BIO、QLS Advisors、Biomedtracker发布的《2011-2020年临床研发成功率及其贡献因素》表明，临床药物从临床一期到最后批准上市，在有生物标志物的参与下，药物研发的成功率是没有生物标志物参与的一倍多，达到15.9%^[5]，生物标志物的参与极大的促进了临床药物研发的效率。因此，药企可通过转变药物的研发模式-监控生物标志物的变化，从而缩短上市时间，节省研发经费。

图3. 生物标志物参与下的药物研发成功率^[5]

二、生物标志物检测技术及检测方式

2.1 生物标志物检测技术

根据生物标志物的分子量大小不同，我们可以选择相适应的检测平台，如图4所示。

图4. 生物标志物的检测平台

非蛋白类生物标志物检测平台：非蛋白类的生物标志物包含脂类、多糖、氨基酸、脂肪酸和维生素等内源性物质。代谢物组学作为连接基因型和表型的桥梁，是研究关于生物体被扰动后（如基因的改变或环境变化）其代谢产物（非蛋白类内源性代谢物质）种类、数量及其变化规律的科学。目前，对于这些代谢物组学相关检测平台主要有NMR、LC-MS 、GC-MS三大检测平台^[6]，各自优缺点如表1所示。LC-MS具有高灵敏度和检测范围广等特点，因此是代谢物组学的主要检测平台。

表1. 非蛋白类生物标志物的检测平台

蛋白类生物标志物的检测平台：对于游离态蛋白类生物标志物检测平台有ELISA、MSD、SIMOA、Luminex、Ella等，这些检测平台的原理及特点如表2所示。对于非游离态类生物标志物，检测平台有流式细胞术、荧光显微镜和激光共聚焦显微镜等。

表2. 蛋白类生物标志物的检测平台

激素类或肽段类等生物标志物检测平台：由于激素类或肽段类生物标志物分子大小介于非蛋白类生物标志物和蛋白类生物标志物之间，因此经过优化的ELISA或质谱平台可以作为其检测平台。

2.2 生物标志物检测方式

根据具体的实验目的，生物标志物的检测方式可分为定量检测和半定量检测。

定量检测能够准确获取样品中待测分析物的准确浓度。对于定量检测，选择合适的方法配制校正标样和质控样品非常关键。然而对于生物标志物来说，实际的生物基质中通常含有未知量的目标分析物，因此不适合用常规的方式配制校正标样和质控样品。基于这种特征，可采用不同的方法解决这个问题。常用的是替代基质法和替代化合物法对生物标志物进行定量检测，如图5所示。

*IS：稳定同位素标记的目标化合物同时作为内标和替代化合物

图5. 生物标志物的定量检测

迄今为止，替代基质法是定量检测生物标志物等内源性化合物最常用的方法，对于降低或升高目标生物标志物的实验目的都适用。在用LC-MS或免疫亲和检测化合物时，需要完整的标准曲线和质控样品。然而该方法由于标样和真实样品中基质不同，会产生基质效应，回收率差异等问题，通过采用稳定同位素标记的目标化合物作为内标的方式，可以较好地校正这种基质效应以及回收率不同所导致的问题。

替代分析物法就是引入机体内不存在或较少，但经过验证和校正后与目标生物标志物信号一致的替代分析物帮助进行检测的方法。这些替代物质常采用稳定同位素标记的目标化合物，因此实验中较替代基质法需至少多一种稳定同位素标记的目标化合物。由于该类方法可以采用与生物样本一致的真实基质做标准曲线或直接在样品中进行检测，可有效消除基质效应和回收率的差异。替代分析物法又包括替代化合物法、单点内标法和多点内标法。替代化合物法和替代基质法类似，需要完整的校准标样和质控样品以获取样品的准确浓度，但需要两个同位素标记化合物，其中一个作为替代的化合物在真实基质中配置标曲，另一种作为内标使用。

单点内标法仅需要一个同位素标记化合物，无需标准曲线就可准确获取一定范围的样品浓度。多点内标法则需要多个稳定同位素标记的化合物同时作为替代化合物加入到样品中，且最终浓度不同，形成标准曲线。通过比较目标化合物和这些替代化合物的信号得出目标化合物的浓度，该方法可检测的浓度范围较单点内标法更广泛。

半定量检测：对于仅需要了解目标生物标志物的相对变化趋势的实验，可采用半定量的检测方式。半定量检测根据分析要求不同，有不同的扫描模式，如图6所示。

图6. 生物标志物的半定量检测

在半定量的分析方法中，对于已知目标待测物的离子通道，在用LC-MS分析化合物时，选择性的扫描特定的离子通道即可。而采用免疫亲和检测，需要在有完整方法调试的前提下才能进行半定量检测，其实验步骤和定量检测法区别不大。因此，半定量法目前较多应用于LC-MS平台，而未在免疫亲和检测有较多的应用。同时相较于常规的串联质谱只能关注有限的离子通道，高分辨质谱可以利用超高的分辨率，采用全扫描模式来监测目标化合物及其代谢通路上潜在的代谢产物信号，可以在有限的样品中最大范围内获取样品信息。因此，如果已知部分目标化合物的信息，还需更广泛地了解样品的信息，可采用高分辨质谱进行全扫描的方式进行半定量检测。

三、生物标志物检测中的映像因素

由于生物标志物是内源性物质，存在许多特性，在进行样品中生物标志物检测的时候，会遇到和常规化合物不同的问题。结合药明康德药性评价部的实践经验，可以从以下几个方面来解决生物标志物在样品检测中遇到的问题。

3.1 非蛋白类生物标志物

替代基质与真实基质的差别：真实生物基质中存在目标分析物会影响分析的准确度。目前，常见的替代基质有包括：缓冲液（PBS buffer或在PBS buffer中添加2-6%的牛血清蛋白）；经净化后的基质（基质中的物质用活性炭去除）；免疫亲和提取后的基质；商品化的人造生物基质等等。因此，对一个成功的采用替代基质的生物标志物分析方法而言，最重要的就是矫正替代基质与真实基质的差别对内源性分析物检测的干扰。

基质效应：生物标志物由于其分子量较小，类似物较多等因素，容易受到生物基质中其它内源性物质的干扰，从而导致LC-MS分析中不同程度的离子化增强或离子化抑制效应。目前主要采用三种方式来消除这些干扰因素：在样品加入同位素标记内标进行校正；稀释样品；对化合物在真实样品中进行加标回收质控分析等，可以较好的消除这些影响。

溶解度：多数生物标志物具有亲水性，不易溶于常规的二甲亚砜或乙腈等有机溶剂，故在方法开发初期需要筛选合适的溶剂、pH值等进行母液的配置。

稳定性：生物基质中存在某些酶系统，如蛋白酶，金属中心酶或酯酶，样品采集后，这些酶仍然会介导某些生物标志物继续分解或转化。因此，可先了解生物标志物的代谢通路和结构，找到不稳定的相关基团。而且可根据目标生物标志物在样品中的浓度范围，调整真实基质中的测试浓度进行稳定性测试，或利用稳定同位素标记的目标标志物或同系物来模拟测试目标生物标志物在真实基质中的稳定性，分析不稳定的原因，结合化合物的结构信息，代谢通路信息寻找合适的解决方案。

色谱柱保留较特殊或从样品中提取较困难：生物标志物的极性范围广，存在亲水和亲油的化合物，可能出现从样品中提取较困难或在常规色谱上保留较特殊等问题。常见的解决方案有：对于较为亲水的化合物，甲酸或一定浓度的三氯乙酸水溶液是较好的提取试剂；亲油性的化合物，常采用乙腈或液液萃取的方式进行提取。如在色谱上保留较特殊的话，可以从以下的柱子类型进行筛选选：C18、T3、Gemine C18、AQ 、PFP、HILIC；针对化合物的极性特征改变流动相的pH或使用离子对试剂，可实现化合物的色谱行为的改变以达到保留的目的，另外，对化合物进行衍生的不可逆性的改变，也是实现化合物在色谱柱上保留的重要方式，如常见的氨基酸的衍生，醛类化合物的衍生等等。

干扰：因生物标志物的内源性特征以及样品中有目标生物标志物的同分异构体存在，生物标志物易受其他色谱共流出内源性物质或同分异构体的干扰。对于这些干扰性物质，最常见的解决方法是在液相色谱上实现分离，消除干扰。对于含有官能团的分析物，如酚羟基、醇羟基或氨基进行衍生化后，可改变目标物或干扰物的色谱行为，从而实现分离。

3.2 蛋白类生物标志物

关键试剂：基于LBA的蛋白类生物标志物的定量分析，对关键试剂的依赖较大，为保证分析的质量，选择的试剂要求特异性好、结合能力强，且必须要用替代基质。

灵敏度要求高：大分子蛋白特别是细胞因子等，其在生物基质中的含量非常低，常常要求其灵敏度达到fg/mL级别。

蛋白亚型：内源性大分子蛋白往往有不同的剪接体、不同的亚型，对其检测提出了挑战。

平台的筛选：结合生物标志物的性质和各检测平台的优劣选择合适的检测平台。

结语

生物标志物目前已成为药物研究与开发的重要工具，随着生物标志物的广泛应用，越来越多的信号分子和通路被确证为药物的治疗靶点。而且生物标志物作为一种能够指示药物的生物药理活性的探针，可以精准研究药物活性，并对临床试验具有很好的预测性。对于生物标志物进行检测和监控，需要结合实验目标进行定制化实验设计，选择合适的检测平台和技术手段。药明康德DMPK具备丰富的生物标志物检测经验和完善的检测平台，致力于提升合作伙伴的药物研发成功率。

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。 

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作者：张宏宏，王洪梅，邢丽丽

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟