核酸药物有望成为继小分子和抗体药物之后的第三浪潮。
大多数小分子和抗体类药物靶向蛋白，主要都是作用于蛋白质，通过增加或者抑制蛋白质的功能达到治疗的作用。已知的蛋白靶点有 2000 多种，但真正能成药的靶点只有不到20%，大多数的靶蛋白是不能通过传统的药物研发手段进行干预的。但核酸药物靶向的是蛋白的装配线，靶点非常丰富，适用疾病谱范围广，核苷酸药物将药物研发带入一个全新的阶段。
核酸药物包括寡核苷酸， 最近非常受欢迎的mRNA疫苗，以及靶向RNA的小分子等。寡核苷酸药物在核酸类药中，发展的最早，技术最成熟。
一、寡核苷酸的种类
寡核苷酸的种类很多，包括小干扰核酸（siRNA）、反义核酸（ASO）、微小RNA（miRNA）和核酸适配体（Aptamer）等等。目前有15款寡核苷酸类药物经过FDA或者EMA批准上市，其中9款为ASO，5款为siRNA, 从2018年开始，每年都会有2-3款寡核苷酸药物被批准。截至2022年，市场上和临床开发中的寡核苷酸已在 14 个治疗领域的 102 种不同适应症中获得批准或测试（图1），其主要的治疗领域为代谢紊乱，癌症，神经病学和眼科等 。
图1. 截至2022已上市寡核苷酸药物
以寡核苷酸为代表之一的new modality在药物研发中所占比例越来越大。已经上市的寡核苷酸药物，主要还是针对罕见病, 例如杜氏肌营养不良症，急性肝卟啉症，及脊髓性肌萎缩症。
目前在研的寡核酸类药物超过2000多个，而相关的公司超过400多家，主要分布在欧美。随着技术的发展，寡核苷酸类药物的适应症也已经从罕见病转向常见病，如肿瘤，代谢，炎症等。中国的寡核苷酸药物研发也进入了一个快速发展的阶段，有12 款寡核苷酸药物进入临床实验，主要针对肿瘤和乙肝。
图2
二、寡核苷酸药物的作用机理
主要的寡核苷酸药物是siRNA药物和ASO，二者主要作用于细胞质的mRNA，通过碱基互补识别和抑制靶mRNA，实现对蛋白表达的调控，达到治疗疾病的目的。
siRNA是双链的短寡核苷酸分子，能够结合AGO蛋白组装成RNA诱导沉默复合体（RISC），其一条链被降解，另一条链通过碱基互补配对原则结合并切割降解靶基因mRNA，阻断靶蛋白的表达，从而达到治疗相关疾病的目的。
ASO是一种单链寡核苷酸分子，进入细胞后在核糖核酸酶H1（RNase H1）的作用下通过序列互补与靶标mRNA结合，引起mRNA的降解，从而抑制蛋白的表达；或通过空间位阻效应调控基因的转录，实现RNA前体的选择性剪接、调控蛋白的表达和功能，起到治疗疾病的作用。
miRNA是一类由内源基因编码的非编码单链RNA分子，由具有发夹结构的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。miRNA与多种生理和病理过程有关，包括癌症、细胞周期进展、传染病、免疫、糖尿病、新陈代谢、肌生成和肌肉营养不良，因此成为了新药开发的一个重要靶点。
Aptamer是一段20~100个核苷酸分子组成的单链分子，可以形成二级结构与靶蛋白紧密结合，从而达到抑制的作用。
图3
三、寡核苷酸药物的研发优势
相比较于小分子和蛋白类药物，寡核苷酸拥有众多优势。首先寡核苷酸药物的设计简单，多数核酸类药物的作用基础是碱基互补配对原则，只需知道靶基因的碱基序列，核酸药物的序列设计就十分容易，化学修饰和递送系统的设计与序列的设计是相对独立的。目前有多款核酸序列设计软件，对多项参数进行全面分析，综合考虑序列保守性、同源性、免疫原性、脱靶等因素，大量快速针对寡核苷酸序列实现跨物种序列比对和同源性分析，选出特异性高、有潜在活性的优质寡核苷酸序列。寡核苷酸化学合成相对简单，工业化级别放大、合成技术都很成熟，也有公斤级的寡核苷酸合成。
图4
基于以上的优势，寡核苷酸药物的研发周期大大缩短， 我们以一个为单一病人研发的寡核苷酸药物Milasen为例，从idea到first injection只用了十个月时间。寡核苷酸药物在研发成功率上具有划时代的优势。以siRNA 领域领先公司 Alnylam 为例，该公司的研发项目从1期临床进展到3期临床试验结果积极的成功率达到 64.3%，远远高于新药开发的行业平均值5.7%。
四、寡核苷酸药物研发面临的挑战
挑战一 化学修饰和递送系统
外源的寡核苷酸想要进入体内发挥作用需要克服多重阻碍：
不稳定，且易被体内的核酸酶降解；
核酸药物分子结构较大，且带有负电荷，穿透细胞膜的难度较高；
核酸分子进入细胞后需要从内吞体中逃逸至细胞质中；
核酸分子具有免疫原性，会激活人体免疫系统的反应。
图5
随着新技术的发展，部分难题已经有较好的解决办法，化学修饰和递送系统技术的突破对核酸药物的发展起到了至关重要的作用。
核苷酸进行的化学修饰（包括对核糖、磷酸骨架、碱基以及核酸链末端等）可增强核酸药物的稳定性和降低免疫原性。
核酸药物需进入细胞内才可以发挥作用，由于核酸药物分子量较大且通常带负电荷，因此被细胞摄取的效率和内吞体逃逸的效率比较低，因此需借助递送系统的力量。目前应用较为成功技术为脂质纳米颗粒（LNP）包裹，和将核酸药物与特定的配体偶联使其能够靶向特定细胞，如GalNAc。
图6
挑战二 生物分析方法
寡核苷酸药物及其代谢物的定性定量分析是药物开发和评估所必需的,良好的生物分析方法对于药代动力学及毒理的研究至关重要。寡核苷酸的分子量在7000-15000Da,基于大小分子之间，所以寡核苷酸的生物分析既需要用于小分子生物定量分析的色谱类分析方法 （Chromatographic Assays）又需要用于大分子定量分析的配体结合类的分析方法 （Ligand Binding Assays）。寡核苷酸的生物分析面临许多挑战：
独特的物理化学性质
寡核苷酸带负电荷，极性大，具有很强的亲水性，而不同的化学修饰和递送系统，会影响寡核苷的化学物理特性。因此实验技术人员在开发定量生物分析需要根据理化性质、化学修饰、载药系统、偶联物性质选择不同分析平台，包括以分子杂交为基础的液相色谱 - 荧光色谱联用技术(Hybridization LC-fluorescence)及酶联免疫吸附测定法(Hybridization ELISA)，同时还需要对不同序列的寡核苷酸，设计合成和筛选不同的探针。
涉及多个生物分析方法
寡核苷酸药物研发的不同阶段对检测灵敏度的需求的不同，并且不同的样品类型对检测灵敏度的需求也会不同，需要选择适当的分析平台。当多种分析方法用于分析同一寡核苷酸药物不同阶段的样品，还需要进行相互验证。
涉及多个类型的样品分析
寡核苷酸药物在几分钟到几小时内从血浆快速分布到组织, 随后是一个或多个较慢的处置阶段, 长达几周至几个月的半衰期。寡核苷酸药物在全身组织中分布超过80%，主要是肾脏和肝脏，其暴露量是血浆中的几百到几千倍，因此寡核苷酸在各个组织中的暴露量是药代动力学及毒理研究的重要数据。通常寡核苷酸药物的组织分布会涉及十几种不同的组织，其样品的采集，组织样品的匀浆，基质效应都是生物分析的方法开发需要解决的问题。
免疫原性
寡核苷酸药物在体内会产生免疫原性，但寡核苷酸的抗药抗体检测一直是生物分析中的难点。主要是因为，相比于抗体类药物，寡核苷酸分子量较小并带大量负电荷，易与体内带正电荷的生物分子结合，因此与抗药抗体结合能力差，对分析方法的灵敏度要求高。此外，体内大量的DNA或RNA片段也会与抗药抗体结合，会对实验产生干扰。
五、定量分析技术推进寡核苷酸药物研发
药明康德药性评价部拥有专业的寡核苷酸生物分析团队，专业的仪器和设备，涵括了三重四极杆质谱和高分辨质谱在内的质谱检测平台、荧光检测平台、配体结合检测平台及qPCR检测平台的5大生物分平台（图7），可以实现高质量的体内外数据交付，多样化的生物分析，加速药物研发进程。
图7 寡核苷酸生物分析平台
质谱检测平台：质谱质谱技术平台因不需要特殊探针的设计和合成，具有定量分析方法开发周期短，较高特异性的特点，同时也可对代谢产物进行定性和定量分析。在核酸药物检测领域已得到广泛应用，但仍然存在诸多挑战，比如样品制备、提取、离子对试剂对质谱信号的抑制等。我们建立了包含高分辨质谱在内的寡核苷酸质谱分析平台，检测灵敏度在1-10 ng/mL，支持早期筛选及临床前药代动力学研究。
荧光检测平台：对于较长（25-60 nt）的寡核苷酸或者结构特殊的寡核苷酸，也可利用一条与待测寡核苷酸互补配对的荧光探针与目标寡核苷酸结合，用液相进行分离，并用荧光色谱对核酸及其已知的代谢产物进行间接的定量分析。针对这个平台，我们可以提供应探针的设计及筛选，该平台检测灵敏度在1-5 ng/mL。
配体结合检测平台：配体结合类的分析方法也可用于较长的寡核苷酸的在生物基质中的定量分析，检测灵敏度可达50 pg/mL。其对寡核苷酸的化学修饰和偶联包容性强，但容易受到代谢产物的干扰。我们已经开发了基于杂交的酶联免疫吸附测定法（Hybridization based Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, HELISA）和MSD®电化学发光法用于生物基质中寡核苷酸的定量分析，该平台检测灵敏度为50 pg/mL。
qPCR检测平台：qPCR分析方法具有较高的灵敏度，但寡核苷酸长度较短，通常需要使用茎环法PCR或者重叠延伸PCR法。针对配体结合平台、荧光检测平台和质谱平台都有相应的法规指导，但qPCR平台用于寡核苷酸的定量分析还没有明确的法规指导，只有行业白皮书做出的建议。我们根据寡核苷酸药物研究经验，各国药监部门发布的关于寡核苷酸药物开发的注意事项及前沿文献研究，建立起一套完整的生物分析方法的开发和验证流程，其平台检测灵敏为 10 pg/mL。
结语
寡核苷酸药物的药代动力学研究需要结合寡核苷酸本身的性质、化学修饰和递送技术原理与特点，建立起完整的评价体系。期待更多的寡核苷酸药物被研发，填补目前未满足的临床需求。
药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。
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作者：赵楠
编辑：方健
设计：倪德伟
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