基于生物标志物的靶向代谢组学技术平台及其应用

生物体内的生化反应是生命体维持生命的基础反应，作为生物学过程的终端产物，内源性小分子（主要是相对分子量1000 Da以内的生物标志物）的改变能够反映细胞功能的变化。研究表明，包括癌症在内的多种疾病，如肝脏疾病、肾病、心血管和神经系统疾病等，都与细胞内代谢状态改变导致的生理学紊乱或细胞功能缺失有关。

代谢组学（ Metabonomics / Metabolomics ）是较新的组学领域之一，其研究的是生物体系在受内外刺激或扰动的前后，多种内源小分子代谢物的种类及其含量变化或其动态变化。通过对代谢产物种类、数量及其变化规律的检测和分析，来研究集体生命活动发生和发展的本质。代谢组学使研究人员能够通过定性和定量代谢物水平（给定表型的内源性小分子），来补充疾病的基因组和蛋白质水平的信息。相比于其他组学方法，代谢组学更接近研究代表健康和疾病的物质，因此也成为了疾病生物标志物发现的重要来源。

图1. 生物研究中各组学之间相互关系

代谢组学旨在寻找可能的代谢通路，并对感兴趣的代谢物或通路进行定量分析，是药物开发和毒理学中的重要分析工具。根据检测的需要及方式，其可分为靶向代谢组学和非靶向代谢组学。随着分析检测技术的发展，代谢组学的检测技术也在向高灵敏度和高选择性、成本低、耗时短以及能够涵盖大多数代谢物的方向发展。本文介绍了当前常用的代谢组学的检测技术，并举例说明了靶向代谢组学的应用。

代谢组学的检测平台

代谢组学的研究平台有核磁共振（NMR）、气相色谱-质谱（GC-MS）、液相色谱-质谱（LC-MS）等。根据不同的研究目的，不同样本类型可通过多平台检测，结合各平台结果，以获取可能全面的信息。

图2. 代谢组学研究平台 

核磁共振（NMR）

核磁共振是一种常用的代谢组学技术，由于生物样本中富含氢原子，所以氢核是常用的目标核，其它如碳和磷等也是辅助的检测目标核。核磁共振检测的优点是样本处理简单，且无特定处理方式、测定速度快，既适用于血液、尿液、脑脊液、体液等液体样品，也适用于组织和器官等固体样品；然而其缺点是分辨率较低、灵敏度低、动态范围有限。

质谱

质谱也是一种常用的代谢组学技术，它是基于各物质自身和其在质谱中产生的碎片的质荷比（m/z）来识别各代谢物，并根据各代谢物的相对丰度来进行组学评估。质谱分析也可以适用于各种体液和组织类型的样品。质谱检测的优势是检测速度快、灵敏度高，常常用于小体积的生物样品组学检测。但在质谱分析中，生物样本首先需要处理成为可用于质谱检测的状态，然后通过质谱仪来分析，所以样品处理过程会破坏样品原有的状态，并且前处理较为花费时间。随着高分辨质谱的发展，质谱为代谢组学的研究提供的信息更为丰富。质谱分析的平台主要有气相色谱-质谱联用（GC-MS）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）等方式。

• 气相色谱-质谱联用（GC-MS）

  GC-MS技术相对成熟稳定、分辨率高等特点，数据库较为完善，使得定性功能较LC-MS容易。但因样品处理复杂、耗时长，并且对于不易衍生化或挥发的物质，定性和定量都较困难，这限制了该技术在实际工作中的应用。

• 液相色谱-质谱联用（LC-MS）

  LC-MS使用液相色谱柱来分离不同化学性质的代谢物，然后通过质谱分析来检测和定量这些代谢物。LC-MS优势主要表现在样品制备和前处理相对简单、重现性好、分辨率高、分离和分析范围广；缺点则主要在于数据库的辅助作用较小，没有对照品的情况下，定性相对困难。随着近年来色谱和质谱技术的发展，采用LC-MS技术进行代谢组学的研究范围愈加广泛，使得该技术成为研究代谢组学的常用手段。

代谢组学的分类

根据研究目的的不同，代谢组学可进一步分为非靶向和靶向代谢组学。二者各有优缺点，经常结合使用，以发现和定量差异代谢产物、深入的研究和分析后续的代谢分子标志物。这在疾病研究、动物模型验证、生物标志物发现、疾病诊断、药物研发、筛选和评估、临床监测、植物代谢研究、微生物代谢研究中都发挥着重要作用。

• 非靶向代谢组学 Untargeted Metabolomics

  非靶向代谢组学在无偏向性情况下检测细胞、组织、器官或者生物体在受到刺激或扰动时，内源性小分子化合物的动态变化。通过在液相和气相色谱上不同的保留时间与代谢物的潜在关系，以及各代谢物的碎片信息来识别各代谢物，并通过生物信息学分析手段识别各代谢物扰动前后的差别，筛选出有意义的代谢物，从而识别出可能扰动的通路，找到潜在的生理机制。

• 靶向代谢组学Targeted Metabolomics

  是在非靶向组学的基础上针对特定一类或几类代谢物的研究分析。可以利用全部标准品或部分标准品在仪器上的特性，进行更为精准的定性和定量检测。与非靶向代谢组学相比，靶向代谢组学具有更高的特异性、检测灵敏度和定量准确性，在药物研发中发挥了重要的作用^[1-3]。

靶向代谢组学在药物研发中的应用

在目标疾病动物模型中，靶向代谢组学在多个研究阶段都发挥着关键作用。例如，靶向代谢组学可以用于评估细胞模型的建立是否成功及其稳定性、筛选候选化合物、提供药效的量化评估和研究药效持续性等。此外，靶向代谢组学也可以用于进行探索性实验，以研究特定代谢物与设计的模型之间的关系^[1]。

研究目标代谢物亚型类型与疾病的关系

在法布雷症的研究中，采用靶向代谢组学的方法，比较了正常小鼠和模型小鼠体内神经酰胺三己糖苷（Gb3）的区别。这种方法能够提供准确的代谢物定量数据，从而帮助研究人员深入了解特定代谢通路的变化，并为疾病的诊断和治疗提供支持。

法布雷病（Fabry disease，FD）是一种遗传性脂质紊乱症，由于基因缺陷导致α-半乳糖苷酶A（α-Galactosidase A，α-Gal A）缺乏或者活性减低，造成其代谢底物神经酰胺三己糖苷（Globotriaosylceramide，GL-3或Gb3）及其衍生物脱乙酰基GL-3（Globotriaosylsphingosine，Lyso-GL-3或Lyso-Gb3）在全身蓄积，心脏和肾脏首当其冲，神经、胃肠道、皮肤、眼、耳等多器官和系统也都出现蓄积现象，严重者甚至出现危及生命的并发症。Gb3是判断酶替代疗法药效的生物标志物。

图3. Gb3和Lyso-Gb3以及类似物Gb3 (+18)和Lyso-Gb3(+18)结构示意图^[4]

鞘氨酸和脂肪酸部分的不同修饰会形成不同的Gb3亚型或类似物，在小鼠模型中已报道37种亚型或类似物。由于种类繁多，并且标准品合成困难、成本高、周期长，因此对全部亚型或类似物进行定量是不实际的，如果只定量某几个亚型或类似物，可能会遗漏一些指标信息。在这种情况下，采用靶向代谢组学，既可能降低成本、缩短周期，又可以广泛地监测各个亚型或类似物的变化，为药物开发阶段提供更全面的药效信息。

图4. Gb3各亚型化合物以及Gb3同系物Gb3(-2), Gb3(+18)各亚型化合物^[4]

我们对法布雷症小鼠和野生型小鼠肾、皮肤、心脏和脑中的40多种Gb3亚型及其类似物，9种Lyso-Gb3及类似物进行了监测。结果发现，法布雷症小鼠的皮肤、肾脏和心脏中Gb3的相对含量更多，例如：Gb3(d18:1)(C24:1)(2OH)、Gb3(d18:1) (C16:1)、Gb3(d18:1) (C16:0)、Gb3(d18:1) (C22:0)、Gb3(d18:1) (C24:0)在模型小鼠的肾、皮肤和心脏中有明显蓄积，但在脑中相对含量较小。此外，不同Gb3亚型及其类似物在不同组织中分布倾向也不同，如：Gb3(d18:2)(C17:0)和Gb3(d18:2)(C16:1)主要分布在肾脏，而Gb3(d18:1)(C16:0)主要分布在皮肤和心脏。Lyso-Gb3及其类似物在模型小鼠的肾、皮肤、心脏和脑中也有明显蓄积，其中以Lyso-Gb3、Lyso-Gb3(-2)和Lyso-Gb3(+18)的相对含量最多，与文献报道一致 ^[2]。

图5. Gb3系列化合物在普通动物和模型动物器官中的对比^[2]

研究目标代谢物各位置异构体与疾病的关系

在靶向代谢组学中，尤其是脂质组学，除了需要区分不同亚型的脂质，不同区域脂质基团也会影响生物体中生理以及病症的进展。

例如，磷酸肌醇3-激酶（PI3K），是一种磷酸化并激活PI（4,5）P2到PI（3,4,5）P3的酶，对细胞周期进程、细胞生长、存活、肌动蛋白重排和迁移以及细胞内囊泡运输有调节作用。由于其在肿瘤生物学中的核心作用，PI3K可能成为一个有希望的药物靶点。除了PIPx的脂肪酰基谱在代谢中具有特定作用外，肌醇环上的位置异构体也有重要作用。因此，在分析方法上，分离所有位置异构体并能覆盖不同脂肪酰基种类的脂质组学分析方法是非常必要的 ^[1]。文献中报道了不同脂肪酰基磷酸肌醇的检测，以及其在细胞中的分布，这对于相关药物的研发起到了重要的推动作用。

图6. 磷酸肌醇位置异构体的示意图和色谱图^[3]

图7.  不同脂肪酰基磷酸肌醇各位置异构体在动物组织中的分布^[3]

结语

目前，代谢组学的检测技术已经取得了显著的进展，为疾病诊断和药物研发领域提供了有力的支持。未来，随着技术的不断发展和优化，代谢组学的检测方法将更加高效和准确，为生命科学领域的研究带来更多突破。同时，深度学习等技术的应用也将为靶向代谢组学，尤其是脂质类的靶向代谢组学的研究提供更加广阔的前景。未来，随着技术的发展，靶向代谢组学的检测方法逐渐向高通量、自动化方向发展；生物信息学、化学计量学等方法的引入，为靶向代谢组学数据的处理和分析提供了新的手段，这有助于新药以及更多有意义的生物标志物的发现。软件识别能力的提高、数据库的进一步丰富以及分离技术的提升，将使靶向代谢组学在药物研究中进一步发挥巨大的作用。

药明康德DMPK在生物标志物的筛选和高通量检测等方面积累了丰富的研究经验，已成功建立基于串联质谱和高分辨质谱的靶向代谢组学检测平台，可为客户提供一体化的服务。

表1. 靶向代谢组学研究平台及内容

作者：王洪梅，李陟昱，刘维伊，陈前，邢丽丽

编辑：富罗娜·克里木，钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹

药明康德DMPK依托中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1700个新药临床研究申请（IND）。

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