能否根据直接抑制（DDIM）结果判定时间依赖性抑制（TDI）风险？

CYP酶的抑制是药物临床前研发中重要的药物相互作用考察内容，其中CYP酶的抑制研究又分为直接抑制和时间依赖性抑制。在项目推进的过程中，由于直接抑制和时间依赖性抑制均体现测定供试品对酶活影响的结果，因此不少研究者认为，CYP酶直接抑制实验（DDIM）的结果具有可以预测时间依赖性抑制（TDI）的作用。那么这两个实验在研究中是否存在前后顺序或因果关系，例如，是否仅当DDIM中表现出显著直接抑制作用（即具有较低IC₅₀值）的化合物，才需要进一步开展TDI研究呢？实际上，根据直接抑制实验（DDIM）结果来决定是否进行时间依赖性抑制实验（TDI）的策略是缺乏科学依据的，主要原因如下：

• 实验目的本质不同

  直接抑制实验：旨在评估化合物对代谢酶的直接抑制作用；

  时间依赖性抑制实验：用于判断化合物是否对代谢酶存在时间依赖性抑制。

• 实验设计与评价指标无直接关联

  DDIM实验：通过测定系列浓度化合物对酶活性的即时影响，计算达最大抑制效应50%时浓度（IC₅₀值），用于评估其直接抑制风险；

  TDI实验：采用预孵育设计，比较化合物在NADPH 存在与缺失条件下预孵育后的IC₅₀ 曲线的差异（即IC₅₀ 偏移倍数，IC₅₀ shift），以此判断化合物对代谢酶是否存在时间依赖性抑制。

由于两种实验的机理研究和评价体系相互独立，其核心指标（IC₅₀与IC₅₀ shift）之间缺乏明确的相关性。因此，仅凭DDIM实验结果无法有效指导对TDI风险的评估。下文将作详细阐述。

在临床实践中，多药联用可能引发药物相互作用（drug-drug interaction，DDI），严重时会导致不良反应或影响治疗效果。其中，药物对代谢酶的抑制是诱发DDI的重要因素之一。根据抑制机制的不同，可分为可逆抑制和不可逆（或准不可逆）的时间依赖性抑制。相较于可逆抑制，时间依赖性抑制具有延迟性和持续性的特点，即使抑制剂已从体系中移除，其对酶活性的抑制效应仍会持续存在。根据人用药品技术要求国际协调理事会（ICH）最新发布的药物相互作用研究行业指南（ICH-M12），建议对CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A等关键代谢酶，分别开展可逆抑制与时间依赖性抑制的体外评估^[1]。二者差异具体如下。

作用机制的本质差异

可逆性抑制是化合物与代谢酶之间快速结合和解离的结果。根据结合位点的不同，可分为竞争性、非竞争性、反竞争性和混合性抑制。其共同特点是：在抑制剂从活性位点或异构位点解离后，酶活性可完全恢复^[2]。因此，体内可逆性抑制的持续时间主要取决于抑制剂的消除半衰期。体外研究中，通常通过DDIM实验测定达最大抑制效应50%时浓度（IC₅₀），或其它实验测定抑制常数（K_i），以评估其可逆抑制作用强度。

时间依赖性抑制则涉及不可逆或准不可逆的酶失活机制：

• 不可逆抑制（亦称“自杀性抑制”）：抑制剂被代谢酶催化生成反应性代谢物或本身与酶活性位点发生共价结合，导致酶永久性失活。

• 准不可逆抑制：抑制剂代谢生成的反应性中间体，与血红素中的催化铁形成紧密的非共价的络合物，使酶处于功能失活的状态^[3,4]。

上述机制下，酶活性的恢复不依赖于抑制剂的清除，而取决于机体合成新酶的速率。

体外实验中通常通过TDI实验测定IC₅₀ shift、假一级速率常数（k_obs）或失活动力学参数（即最大失活速率常数k_inact和50%最大失活速率时抑制剂浓度KI）来评估化合物对代谢酶的时间依赖性抑制作用。

基于作用机制的本质差异，DDIM实验和TDI实验在实验设计和评价标准上也各具特点。 

实验设计及评估指标的根本区别

DDIM实验（见图1）采用一步孵育法，将探针底物与不同浓度的测试化合物在代谢酶体系中共同孵育，通过测定探针底物代谢产物的生成量反映酶活性，绘制剂量-反应曲线，并计算IC₅₀值。该实验直接反映化合物对酶活性的即时抑制能力，IC₅₀值越小，化合物对代谢酶的可逆抑制能力越强。

TDI实验（见图1，非稀释法）采用两步孵育法。首先将测试化合物与代谢酶体系在有无NADPH条件下预孵育30分钟，通过增加测试物与酶源（人肝微粒体）含NADPH的预孵育步骤，为测试化合物经代谢生成反应性代谢产物/化学反应中间体，并与代谢酶形成可造成酶活性丧失的不可逆共价，或准不可逆的非共价紧密结合提供有利条件。其中，以无NADPH的预孵育实验组作为对照；随后加入探针底物进行二次孵育，测定探针底物代谢产物的生成量，并绘制剂量-反应曲线，比较两组间的差异。这一设计的关键在于：若在无NADPH参与预孵育组的实验组中，测试化合物的IC₅₀值高于有NADPH参与的组别，且IC₅₀ shift值大于等于1.5，则表明测试化合物对代谢酶存在时间依赖性抑制作用。

图1. DDIM实验及TDI实验流程

比较两个实验的评价体系，DDIM实验基于单一IC₅₀值，重点评估化合物对代谢酶的直接抑制作用；而TDI实验通过计算IC₅₀偏移倍数（无/有NADPH预孵育实验组的IC₅₀比值）进行评估，偏移倍数大于等于1.5提示存在时间依赖性抑制作用。

所以，即使受试化合物在DDIM实验中获得了较小的IC₅₀值，也不能据此推断其具有时间依赖性抑制。

案例分享

常见商品化CYP450酶直接抑制剂的DDIM实验结果（见表1），均具有较小的IC₅₀值，但未显示出对相应代谢酶的时间依赖性作用。

表1.  常见商品化CYP酶直接抑制剂的IC₅₀值及IC₅₀ Shift值

注：表中数据保留三位有效数字

例如，孟鲁司特在DDIM实验中对CYP2C8的IC₅₀值为0.0412 μM，具有明显的酶抑制趋势（如图2）；然而，在TDI实验中，其IC₅₀ shift值仅为0.627，远低于判定阈值，说明该化合物并不具有时间依赖性抑制作用。

图2. 孟鲁司特对人肝微粒体CYP2C8活性（阿莫地喹脱乙基反应）的抑制

反之，某一化合物被证实为时间依赖性抑制剂，也并不意味着其在DDIM实验中会获得较小的IC₅₀值。如图3所示，以苯乙肼为例，在TDI实验结果中显示对CYP2C8具有时间依赖性抑制作用，但其在DDIM实验中的IC₅₀值>100 μM。

图3. 苯乙肼对人肝微粒体CYP2C8活性（阿莫地喹脱乙基反应）的抑制

因此，体外酶直接抑制实验（DDIM）与时间依赖性抑制实验（TDI）是两套独立的酶抑制评估体系，分别应用于评价化合物对代谢酶的直接抑制和时间依赖性抑制，两种实验的原理、检测指标和数据解读均不同，不存在可相互推断的必然关联。不能仅凭DDIM的结果判断是否需要进行TDI实验，必须在独立的实验条件下分别评估，以确保化合物对代谢酶抑制风险的全面判断。

作者：刘茜，马虹莹，姜利芳，陈根富

编辑：富罗娜·克里木，钱卉娟

设计：张莹莹

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