药代动力学研究是药物研发中的关键环节之一，通过分析药物的吸收（absorption）、分布（distribution）、代谢（metabolism）和排泄（excretion）（简称ADME），可揭示药物在体内的时空动态特征。在临床前研究中，深入理解药物体内ADME过程不仅有助于药物的优化，还能预判潜在的临床问题并制定合适的剂量策略。通常，体内药代动力学研究会综合不同研发阶段的需求，选择不同种属进行相关研究。一方面，需要考虑药物的研究进程；另一方面，也需要考虑实验研究的效率和成本。传统PK研究依赖解剖采样与体外分析检测，例如通过在不同时间点安乐动物获取血液或组织样本进行分析。对于初筛阶段的研究，这种方法不仅耗时耗力，还需要大量的实验数据来解读药物在体内的变化情况。若在研究早期使用小动物活体成像技术（small animal in vivo imaging），就可以在非侵入状态下实时追踪同一只动物体内药物的变化情况，实现体内药代动力学研究的“透明化”。本文将系统阐述小动物活体成像技术的原理、优势及其在药代动力学中的应用。
小动物活体成像技术概述
活体动物成像技术通常使用影像学方法对活体状态下的生物进程进行定性或定量的研究（例如组织、细胞和分子水平等）。根据技术原理与应用场景，主要分为以下两类（如图1所示）[1]：
01 功能成像
适用于研究分子代谢和生理学研究；包括可见光成像（optical imaging）、核素成像（PET/SPECT）。
02 结构成像
适用于解剖学成像；涵盖核磁共振成像（magnetic resonance imaging ，MRI）和超声成像（ultrasound）、计算机断层摄影成像（computed tomography，CT）。
与结构成像相比，功能成像更能反映细胞或基因表达在空间和时间的分布，从而“透明化”地体现活体动物体内的相关生物进程、特异性基因功能及相互作用等。因此，活体动物体内功能成像技术可从分子和细胞水平观察和追踪靶细胞、基因的表达，从整体动物水平上评估疾病发展过程，助力药物的优化和完善基因治疗方案。
图1. 活体动物体内成像技术[2,3]
高灵敏度生物光学成像系统由光密闭合成像室、超低温科学级CCD相机及智能分析平台构成。同时，集成化实验模块配备了动物麻醉系统、恒温生理平台及生物隔离单元，可支持从毫秒级瞬态发光到长时程代谢观测的全时域分子影像研究（如图2所示）。体内可见光成像（optical in vivo imaging）技术主要包括生物发光（bioluminescence）与荧光成像（fluorescence）两种技术（如表1所示）。其中，生物发光成像通过使用荧光素酶（luciferase）报告基因标记细胞或DNA，使其表达的蛋白酶与相应底物发生生化反应，从而在生物体内产生探针光信号。这种技术无需外部激发光源即可捕捉发光信号。
现阶段，最常用的光学成像酶是从萤火虫（Photinus pyralis）中分离所得的萤火虫荧光素酶（FLuc）。它以荧光素为底物，在ATP的作用下生成氧化荧光素，并在560纳米波长处发射绿光[4]。此外，海肾荧光素酶（RLuc）和高斯荧光素酶（GLuc）也是两种较为常见的荧光素酶。它们以肠腔素为底物，常与FLuc相结合用于双荧光素酶报告成像（dual-reporter imaging），从多角度评估特定疾病模型动物[5]。
其中，来自海洋动物高斯桡足虫（Gaussia princeps）的GLuc尤为独特：它可在哺乳动物细胞中自然分泌，灵敏度约为FLuc或RLuc的1000倍。因此其血液或尿液水平可作为用于监测肿瘤生长、病毒感染与复制、循环细胞存活能力等生物事件的标志物[6]。这些生物发光蛋白相比于它们的荧光对应物反而更受青睐，这是由于哺乳动物组织中缺乏内源性生物发光反应，可以实现接近无背景的成像[7]。
图2. 生物发光成像与荧光成像示意图
与生物发光成像不同，荧光成像采用荧光报告基因（如GFP、RFP）或Cyt及dyes等荧光染料进行标记，利用荧光蛋白或染料产生的荧光形成体内光源，并需要外界光源的激发才能捕捉发光信号（如表1所示）。相比于活体生物发光成像，荧光成像成本较低且无需向动物注射底物，荧光发光基团在其特定波长的激发光下即可发射相应波长的光信号。只需确保荧光基团稳定，便能实现随时激发随时发光的效果。
此外，由于荧光成像基于物理能量转移的原理，对实验样本的生理状态要求较低：无论是活体动物、动物尸体或是离体器官均可实现光学成像。然而，荧光成像标记物的选择与实际成像效果密切相关，通常建议选择波长较长的近红外标记物，并减少动物本身荧光背景的干扰。近年来，荧光成像的研究热点聚焦于开发发射波段位于第二近红外窗口（NIR-II，1000–1700 nm）的荧光对比剂，以及适用于该光谱范围成像的光学仪器，因为该波长范围下组织的透明度最高，并能在较大的组织深度（约1 cm）内提供最佳的图像分辨率[7]。
综上，生物发光成像仅在活细胞内发生且不涉及放射性物质，具有操作简便、结果直观、灵敏度高等特点。而对于具有荧光标记的组织或药物的相关研究，则可在早期筛选阶段使用活体成像技术，在非侵入状态下实时追踪动物体内药物的动态变化情况[8]。
表1. 生物发光成像与荧光成像的对比
方式 | 优点 | 缺点 |
生物发光成像 |
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荧光成像 |
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小动物活体成像在药代动力学中的应用
基于小动物活体成像的优势技术结合药代动力学研究领域的实际需求，我们总结了以下关键应用场景（图3）：
图3. 小动物活体成像在药代动力学的应用场景
01 药物分布的时空动态追踪
常规PK研究需通过离散采样推断药物分布，而活体成像可实现全程可视化药物在靶器官与非靶器官的差异蓄积。
02 代谢过程实时监测及药动学参数测定
通过双模态探针（如同时标记药物原型及其代谢物），可动态追踪药物在肝脏中的代谢转化与肾脏排泄路径等。
03 药物-靶点相互作用机制研究
利用分子探针（如荧光标记的抗体或适配体）与药物靶点特异性结合，可验证药物与靶点的结合效率及竞争性抑制效应。
通过基因编辑动物模型（如人源化肝细胞小鼠）与活体成像的结合，可更准确地模拟人类药物代谢特征，预测临床剂量下的潜在毒性或疗效差异。例如，利用实时成像技术追踪抗体药物在免疫检查点人源化小鼠体内的靶向效率，可优化药物结构以减少非特异性蓄积。此外，基于成像数据的药代-药效（PK-PD）模型将推动个体化给药方案的开发，特别是在纳米药物或细胞治疗领域，活体成像能够动态评估载体系统的稳定性及靶器官递送效率，为剂型改良提供直接依据。这一技术趋势不仅契合“3R原则”（替代、减少、优化），还将提升药物研发效率，尤其为罕见病或复杂适应症药物的开发提供经济可行的研究路径。
案例分享
SM-102是一种用于mRNA疫苗递送的合成阳离子脂质，在mRNA疫苗开发中发挥了重要作用，特别是在COVID-19疫苗（Moderna mRNA-1273）中，该脂质作为关键成分之一，增强了mRNA的体内递送效率。此外，SM-102也用于肿瘤免疫治疗、基因编辑和RNA干扰疗法，为新型核酸药物的开发提供了重要支持。使用SM-102 LNP包封的FLuc mRNA（FLuc mRNA (m1Ψ)-SM102 LNP）在递送至细胞或体内后，能够实现FLuc蛋白的表达，并在加入荧光素底物后，产生黄绿色荧光（检测波长为550-570 nm）。
实验方法
在小鼠（n=2）肌肉注射给药等同剂量的FLuc mRNA (m1Ψ)-SM102 LNP（如表2所示）后，在不同时间点（2/4/24 h）分别尾静脉注射荧光素底物（D-荧光素钠），并通过小动物全身荧光成像系统实时检测FLuc的表达量与分布。此外，在4 h时间点尾静脉注射底物后，通过连续成像确认荧光信号随时间的变化趋势。
表2. 实验设计
Test Article | Dose Route | Dosage | Conc. | Dose Volume | Time points |
FLuc mRNA (m1Ψ) -SM102 LNP | IM | 15 μg/animal | 0.15 mg/mL | 0.100 mL/animal | 2h, 4h, 24h |
实验结果如图4、图5所示：
给药后，表达的FLuc蛋白主要分布于肝区和注射部位；
相比于其它时间点，给药后4 h Fluc mRNA在肝脏和注射部位的富集程度更高；
注射底物5 min左右观察到较明显的荧光信号平台，5 min后荧光信号呈现逐步下降趋势，并在5-15 min的区间范围内，荧光信号下降比率可达50%。
图4. 不同时间点FLuc在动物体内的表达与分布
图5. 注射底物5 min后荧光信号随时间变化趋势（部分数据）
基于上述实验结果，小动物活体成像技术可高效筛选药物的体内分布情况，并通过光信号的数值转化揭示药物的动态变化趋势。然而，值得注意的是，由于荧光素酶催化反应所产生的荧光信号会随时间衰减，所以需特别关注成像时间窗口的优化（即注射底物后的最佳成像时间范围），以确保数据的可靠性。
结语
随着精准医学和药物研发技术的快速发展，小动物活体成像技术作为临床前药代动力学研究的重要工具，正逐渐成为创新药物开发链条中关键的一环。通过整合光学成像（如生物发光、荧光成像）、核素成像（如PET/SPECT）、磁共振成像（MRI）及计算机断层扫描（CT）等多模态技术，活体成像系统能够实现对药物在活体动物体内动态行为的无创、实时、可视化追踪，为药代动力学（PK）和药效学（PD）研究提供多维度的数据支持。未来，该领域的技术突破与应用深化将持续提升药物研发效率，并推动个体化治疗策略的优化。药明康德DMPK拥有丰富的体内药代动力学研究经验，具备良好的实验基础与专业的技术团队。同时，我们已经建立了各种类型分子的药物测试平台，可满足不同实验需求，为客户提供一体化服务，助力新药研发进程。
作者：焦桴荣，王骁琦，董轩，汤城
编辑：富罗娜·克里木，钱卉娟
设计：倪德伟，张莹莹
药明康德DMPK依托中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1700个新药临床研究申请（IND）。
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参考
[1] Weissleder R, Pittet MJ. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 2008;452(7187):580-589.
[2] Li L, Tong T, Ji Q, et al. Dual pH- and Glutathione-Responsive CO2-Generating Nanodrug Delivery System for Contrast-Enhanced Ultrasonography and Therapy of Prostate Cancer. ACS Appl Mater Interfaces. 2021;13(11):12899-12911.
[3] 杨晶, 杨一兵, 朱高红, 王学红, 邓赟. SPECT-CT核素显像在咽鼓管功能的临床研究[J]. 昆明医科大学学报, 2021, 42(11): 27-32.
[4] J Miraglia L, J King F, Damoiseaux R. Seeing the light: luminescent reporter gene assays[J]. Combinatorial chemistry & high throughput screening, 2011, 14(8): 648-657.
[5] Inoue Y, Sheng F, Kiryu S, et al. Gaussia luciferase for bioluminescence tumor monitoring in comparison with firefly luciferase[J]. Molecular imaging, 2011, 10(5): 7290.2010. 00057.
[6] Tannous B A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo[J]. Nature protocols, 2009, 4(4): 582-591.
[7] Refaat A, Yap M L, Pietersz G, et al. In vivo fluorescence imaging: success in preclinical imaging paves the way for clinical applications[J]. Journal of Nanobiotechnology, 2022, 20(1): 450.
[8] Close DM, Xu T, Sayler GS, Ripp S. In vivo bioluminescent imaging (BLI): noninvasive visualization and interrogation of biological processes in living animals. Sensors (Basel). 2011;11(1):180-206.
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