药物研发提速器：生物标志物检测策略全解析

在创新药物研发过程中，生物标志物作为客观反映机体生理病理状态及药物响应的关键指标，已成为推动药物研发决策的核心工具。其应用贯穿药物研发全流程，从早期靶点筛选与机制验证，到临床试验阶段的患者分层与药效动力学评估，直至上市后的伴随诊断与安全监测。建立精准的生物标志物分析策略，不仅有助于深入理解药物作用机制，还可显著优化临床试验设计并缩短审评周期。本文将系统梳理当前主流的生物标志物分析方法，探讨其各自优势与局限，并围绕“fit for purpose”验证原则展开讨论，以期为优化生物标志物的分析提供新思路，进一步加速药物研发进程。

生物标志物的定义及在药物开发中的意义

生物标志物（biomarker）是指能够客观、准确且可重复测量的生物学指标（如内源性蛋白、核酸、代谢物等），可用于反映机体的生理或病理状态，表征药物干预后产生的特异性生物学响应。该类指标在疾病诊断、预后评估及药物研发等多个领域均具有重要价值。根据FDA与NIH于2016年联合发布的《Biomarkers, Endpoints, and Oher Tools（生物标志物、终点及其他工具）》 （BEST，2016）中的定义，生物标志物可分为如下七种类型^[1,2]。

图1. 生物标志物的七种类别

在药物发现、开发及申报等各个阶段中，生物标志物的检测发挥着关键的决策支持作用。在药物发现阶段，生物标志物可用于药物靶点筛选、阐明药物作用机制，并为概念验证提供关键数据；在临床前研究中，为临床剂量选择与安全性评价提供重要支持；进入临床阶段后，生物标志物可辅助实现疾病诊断分层、患者筛选、剂量确定、药代动力学研究以及安全性与疗效评估；至药物上市阶段，其应用进一步扩展至伴随诊断试剂的开发、临床安全性及有效性的持续监测，以及药品质量控制的强化等方面。

开发适用的生物标志物策略，不仅有助于深入理解药物作用机制，还可指导临床试验中的患者选择，实时监测和预测潜在毒性，为药物研发和监管决策提供科学依据。这些应用显著提升了药物开发的可持续性，增强了药品质量和安全性，同时加速了新药的审批与上市进程^[2,3]。

图2. Biomarker在新药研发各阶段中的关键作用

生物标志物的分析平台

生物标记物种类多样，涵盖小分子、蛋白质、细胞、核酸分子及组织切片等多种类型。不同药物研发领域对生物标志物的检测需求存在显著差异。由于单一生物分析平台难以覆盖所有类型的生物标志物分析需求，通常需要整合多种分析平台进行检测，不同平台各具优势及局限性^[4]。

依据检测原理，目前常用的生物标志物检测平台主要可分为以下三类：

1. 基于液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）的分析平台；

2. 基于免疫测定的分析平台；

3. 基于分子生物学技术的检测平台。

图3. 三类主流Biomarker分析平台

基于液相色谱-质谱（LC-MS）的biomarker分析平台

LC-MS技术结合了液相色谱的高效分离能力与质谱的高灵敏、高分辨检测特性，具备很强的分析特异性，尤其适用于复杂生物基质中多种生物标志物的精准定量分析，如激素、氨基酸、多糖、脂肪酸和维生素等。近年来，随着Hybrid LC-MS/MS技术（即免疫捕获-LC-MS技术）的不断发展，该平台在蛋白类生物标志物检测中也展现出显著优势。该技术首先利用特异性免疫捕获试剂富集目标蛋白，随后酶解产生特征替代肽（signature peptides），最后借助LC-MS/MS实现高选择性、高灵敏度的检测。此外，在某些应用场景下，LC-MS平台还可提供较传统免疫分析方法更为灵敏和准确的分析方案^[5,6]。

基于免疫测定的biomarker分析平台

配体结合分析（ligand binding assay, LBA）是目前应用最广泛的生物标志物检测分析平台之一，凭借其高灵敏度、高特异性和高通量的特征，已成为生物标志物的核心检测手段。

图4. 基于免疫测定的生物标志物分析平台

基于检测技术和发光原理的差异，目前常用的免疫测定分析平台主要包括：

• 酶联免疫吸附试验（ELISA）

• 电化学发光法（ECL）

• 基于微球的Luminex/CBA平台

• 流式细胞术

• 酶联免疫斑点印记（ELISpot）

• 单分子免疫阵列技术（Simoa）

• 基于微流控芯片的GyroLab平台

这些平台在灵敏度、定量范围、样品需求量以及检测通量方面各具优势。在实际应用中，需要综合考虑目标分子类型、检测灵敏度、样本量、多重性以及设备可获得性等因素，以选择最适合的检测平台^[7,8]。

例如，ELISA由于操作简便且成本低，常被优先选择作为常规检测平台；MSD、Luminex以及CBA技术则更适用于高通量多因子检测；Simoa凭借其超高灵敏度，特别适用于神经退行性疾病生物标志物等极低丰度目标的检测。在功能分析方面，ELISpot可用于细胞因子分泌活性等细胞功能性指标的检测；流式细胞术适用于免疫细胞分型及一些胞内标志物的分析；而对于一些小体积样本，如脑脊液，则可选择GyroLab平台。在实际选择免疫分析平台时，除了需要考虑上述因素外，还应综合考虑仪器可及性等实际条件。 

此外，除上述定量免疫分析技术外，半定量分析技术也在生物标志物检测中发挥重要作用。其中蛋白质免疫印迹（western blot）广泛用于蛋白表达水平验证、分子量确认、翻译后修饰研究以及非可溶性蛋白的半定量检测；免疫组化（immunohistochemistry, IHC）除可进行半定量分析外，还可提供蛋白在组织中的空间定位信息，通过结合组织病理学特征，在病理诊断和机制探索中发挥重要作用，并广泛应用于免疫细胞浸润、肿瘤异质性等组织微环境相关研究。

表1. 基于免疫测定的生物标志物分析平台对比

基于分子生物学的biomarker分析平台

除了上述LC-MS和免疫测定平台外，部分生物标志物（如DNA和RNA）难以通过这两类主流技术实现有效分析，更适合采用分子生物学平台进行检测。核酸类生物标志物广泛应用于疾病诊断与预后评估，其来源包括组织样本及唾液、尿液、血液等体液样本（液体活检），已成为癌症早期筛查、肿瘤进展监测、药物疗效评价与耐药性评估的重要工具。

目前，分支DNA（branched DNA, bDNA）技术、荧光定量PCR (qPCR）和数字PCR（dPCR）技术是长链核酸定量的主要手段。其中，PCR技术（尤其是dPCR）相比bDNA技术具备更高的灵敏度，不仅适用于基因治疗药物的安全性评估需求，还可用于评估药物跨越血-乳腺、血-胎盘和血-脑屏障的潜在风险。此外，PCR平台在检测方案设计上灵活性较高，能够通过特异性引物设计精准分析DNA或mRA特定区域的结构完整性。随着组学技术的持续进步，代谢组学、基因组学、蛋白组学及空间多组学等前沿平台也为生物标志物的高通量、高精准分析提供了更丰富的选择和支持。

“Fit for Purpose”的生物标志物验证策略

生物标志物分析是药物研发过程中的重要工具，但鉴于其分子类型多样、分子大小不一及用途多样性，目前尚未形成国际统一的验证体系，监管框架呈现多元化特征。从全球监管现状看，主要药品监管机构对生物标志物分析方法验证的规范存在明显差异。例如，中国药典及欧洲药品管理局（EMA）发布的临床生物分析相关法规中，均未设立针对生物标志物分析方法验证的专项指导原则。相比之下，FDA在2013年发布的《生物分析方法验证指南》中首次明确提出“适用性目的（fit-for-purpose）”的验证策略，并在2018年修订版指南中进一步强调：鉴于生物标志物在药物研发中的多维度应用场景特性，其分析方法的验证范围确定必须基于具体应用场景，实施适应性验证策略。

尽管目前已有一系列白皮书发表，但生物标志物分析方法的验证内容仍随着分子类型的多样性及分析技术的进步日渐演变。当前，基于风险与效益的分级验证体系已逐渐成为行业共识：当生物标志物数据涉及药物安全性、有效性评估或剂量确定等关键注册申报内容时，须执行完整方法验证；而对于早期研发阶段（如候选化合物筛选、概念验证等）的支持性数据，申办方可依据研究目的，灵活选择验证要素。这种分层验证模式既保证了关键数据的可靠性，也兼顾了研发效率^[9]。

2019年11月，在“生物标志物方法开发与适用性验证的最佳实践”专题研讨会上，与会专家就生物标志物分析方法的验证参数和关键统计指标进行了深入讨论。结果显示，超过60%的专家认为精确度、准确度、平行性、稳定性及特异性等是核心验证参数；另有75%的受访专家支持建立统一的生物标志物方法验证最低标准^[10-12]。

图5. 专题研讨会调查结果：生物标志物验证方法的关键标准^[10]

药明康德DMPK已建立多类生物标志物的验证标准，并针对不同分子类型与研究目的制定了相应的验证参数。例如：

1. 在猴血清中Biomarker1的分析方法验证中，主要考察了准确度与精密度、钩状效应与稀释线性、选择性、平行性及稳定性等参数；

2. 在猴血浆中Biomarker2的分析方法验证中，涵盖了准确度与精密度、钩状效应与稀释线性等指标；

3. 针对猴血清中Biomarker3的分析方法，进行了更为全面的验证，包括准确度与精密度、钩状效应与稀释线性、选择性、特异性、平行性、稳健性及稳定性等参数。

图6. 以Biomarker1为例的验证实验数据

这些案例表明，生物标志物分析方法的验证并非采用固定模板，而是根据具体项目目标、分子特性及所处研发阶段的需求，灵活设定验证内容，以实现科学性与实用性之间的平衡。

结语

生物标志物的检测在新药研发中占据不可替代的重要地位，随着技术的发展，其分析手段也日趋多样化，各具优劣。目前，药明康德药性评价部已建立覆盖多个研究领域的生物标志物检测组合，包括细胞因子类、神经系统相关、激素类、肿瘤类、补体类等，能够支持当前热点研发方向的候选分子，并具备丰富的开发与检测经验。平台已完成数百项生物标志物的定量分析，涉及小鼠、大鼠、兔、犬、猴等多个实验动物种属，相关指标情况如下表所示。

表2. 药明康德DMPK平台多物种适用的生物标志物检测能力示例

作者：张雪，任文瑞，宋苗苗，张多，邢丽丽

编辑：富罗娜·克里木，钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹

药明康德DMPK依托中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1700个新药临床研究申请（IND）。

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