偶联药物的连接子及其对药物性质的影响

近年来，各种形式的偶联药物开发如火如荼，特别是以抗体偶联药物（Antibody-drug conjugate, ADC）为引领的偶联药物在癌症治疗上取得了巨大成功。在研药物中还有很多不同形式的偶联药物纷至沓来，不仅有常见的多肽偶联药物（Peptide-drug conjugate, PDC），还有小分子偶联药物（Small molecule-drug conjugate, SMDC）等其他形式。这些偶联药物作用机理大体是相似的，通常偶联药物中抗体或多肽相当于一个精确定位的“导航仪”，小分子药物相当于“子弹”，连接子（Linker）相当于连接前两者的“纽带”。给药后，“导航仪”将“子弹”带到肿瘤部位，然后释放“子弹”杀伤肿瘤细胞，从而发挥抗肿瘤疗效。

“导航仪”和“子弹”对于肿瘤靶向的偶联药物是非常重要的部分，连接子的作用同样关键。随着偶联药物的开发迭代，以及临床上成功和失败经验的累积，目前已经确定连接子是整个偶联药物设计的关键元素。本文将重点介绍偶联药物连接子的种类及其对药物性质的影响。

一、上市及在研药物中的连接子介绍

目前上市的ADC药物中，连接子大概分为四个类型，不可裂解型连接子和三种可裂解型连接子（酶可裂解型、酸可裂解型和GSH可切割还原型）（图1）^[1]。已上市ADC药物共有15款（表1），其中不可切割型连接子有2款，酸可裂解型连接子有3款，酶可裂解型连接子有8款，以及GSH可切割还原型连接子有3款（Mylotarg和Besponsa的连接子属于酸可裂解型和GSH可切割还原型连接子的组合连接子）。其中药物Akalux由于其特殊结构，没有连接子。相比已上市药物，在研药物中的连接子更是多种多样，除了刚才所提到的4种连接子外，还出现了一些新型连接子，比如Fe(II)可切割连接子，光响应可切割连接子和生物正交可切割连接子等^[2]。

图1. 偶联药物连接子种类

 表1. 上市的15个ADC药物基本情况

备注：¹部分有效载荷的结构见文末附图1。²Mylotarg最初与2000年上市，2010年退市，2017年9月重新上市。

图2. 连接子部分的缩写对应的结构

酸可裂解连接子无疑在偶联药物的发展中占据一席之位，包括上市的ADC药物Mylotarg、Besponsa和Trodelvy均使用酸裂解型的连接子（图3）。酸可裂解型连接子主要有腙和碳酸酯这两种结构。酸可裂解连接子主要在酸性肿瘤微环境（pH 6.5-6.9）或酸性细胞区间，即细胞的内体（pH 5.5-6.2）和溶酶体（pH 4.5-5.0）中被裂解，而在血液循环中保持相对稳定（pH7.4）^[3]。这种策略在偶联药物Mylotarg上获得了最早的临床成功。然而，酸可切割型连接子的稳定性不足严重限制了其在ADC上的应用。因为循环系统中的有效载荷可能进入正常细胞，增加了药物的毒副作用。第一个ADC药物Mylotarg药物因毒副作用于2010年撤市，改进其给药策略及患者人群后在2017年重新获准上市。

图3. 已上市含有酸切割连接子的ADC药物

血浆中谷胱甘肽（GSH）水平为∼5 μmol/L，而正常细胞的细胞质中GSH含量达到1-10 mM的水平。由于肿瘤微环境中的氧化应激和缺氧，癌细胞中的GSH浓度可能会进一步增加，有利于二硫键连接子的偶联药物在癌细胞内快速释放^[4]。美登素类衍生物如DM1、DM3和DM4自带自由巯基，形成二硫键后经GSH切割可以直接释放出有效载荷（图4 a），在研的药物例子如Bicycle Therapeutics的BCY6135^[1]。大部分有效载荷不带有自由巯基，可以与自焚型单元接上自由巯基后，再形成二硫键（图4 b），在研的药物例子如mAb-SG3231和mAb-SG3451^[5]。

细胞内的溶酶体和肿瘤微环境中存在特异性的酶可以选择性裂解连接子。如溶酶体内的组织蛋白酶可以水解肽键，如二肽或四肽类连接子。水解β-葡萄糖醛酸盐和β-半乳糖苷的糖苷酶，水解焦磷酸酯和焦磷酸盐的磷酸酶以及水解硫酸盐的硫酸酯酶^[4]。如图5所示，二肽的结构需要满足在P1位有亲水性残基，P2处有疏水性残基，这样可以被组织蛋白酶水解，在酶切除二肽后PABC很快会发生自身降解，释放有效载荷。

如果说可裂连接子是可以打开的“活结”，那么，不可裂解连接子就是不能打开的“死结”。对于不可裂解连接子，ADC需经内化后被细胞内的溶酶体俘获，抗体被蛋白酶水解为肽或氨基酸，再被逐步分解成有效载荷相关成分而起作用，这也要求肿瘤细胞有高表达的抗原^[6]。已经上市的Kadcyla和Blenrep就属于不可裂解型连接子（图6）。不可裂解连接子通常具备较长的血液半衰期，脱靶的可能性也较低。一般不可裂解连接子主要包括马来酰型以及含硫醇己酰胺型连接子，通过形成酰胺键（图6中Kadcyla的连接子）以及硫醚键（图6中Blenrep的连接子）将小分子药物与抗体/多肽偶联。肟型和三氮唑型连接子现在也被用于设计不可裂解型连接子^[1]。这四种连接子的性质总结见表2。

图4. GSH切割的连接子的两种类型及在研药物例子

图5. 组织蛋白酶切割连接子的例子

图6. 含有不可切割的连接子的药物例子

表2. 4种连接子性质总结

二、连接子选择的考量因素

连接子是将有效荷载与多肽或抗体相连接的化学结构。从成本和生产难度考虑，连接子首先要易于与多肽或抗体进行连接，且不应影响多肽或抗体对其受体的亲和力。而且对于抗体偶联药物，需要很高的水溶性能促进生物偶联，避免不溶性聚集体导致失活。

由于连接子和偶联方法的改进，偶联药物的发展在过去十年中取得了显著进展。特别是连接子设计在调节偶联药物在体循环中的稳定性和肿瘤中的有效载荷释放效率方面起着关键作用^[7]，一些其他关键的连接子参数，如连接子分支、电荷、极性和亲水性都会对偶联药物的药代动力学（PK）、药效和毒性产生影响（图7）。

图7. 连接子选择的考量因素

三、连接子对药物性质的影响

亲水性对ADC的开发至关重要，连接子的低亲水性会引起很多问题，比如低的偶联效率，ADC在血浆中的沉积，ADC在体内组织的非特异性摄取等^[8]。Burke等^[9]报道了糖苷酶可切割的带有不同PEG长度的ADC药物（图8），在正常Sprague-Dawley大鼠模型中，3毫克/公斤静脉给药后考察ADC药物在体内的药代动力学和毒性，ADC体内暴露随着PEG长度的增加而增加，当PEG长度达到8时趋于稳定。无PEG链的ADC表现出快速的非特异性细胞摄取，导致ADC分解代谢和细胞毒性有效载荷的快速释放，其在第一天内达到血浆和组织浓度的峰值。含有4个、8个或12个PEG的引入导致在所有组织中摄取越来越慢并且有效载荷浓度峰值降低（图9A）。这些具有最小非特异性摄取的ADC还表现出更少的血液学毒性，骨髓的组织学损耗减少。20毫克/公斤静脉给药后，无PEG链的ADC给药组6只SD大鼠全部死亡，含有4个PEG链的ADC给药组有5只SD大鼠在给药10天后死亡，而含有8个和12个PEG链的ADC给药组28天后无动物死亡^[10]。这些实验结果支持了ADC疏水性、非特异性摄取率、有效载荷的释放和由此产生的毒性之间的强相关性。通过调节PEG的长度，可以调节ADC在生物体内的非特异性组织分布，从而可以有效降低非靶点依赖的毒性。提高连接子的亲水性方法包括在连接子上连接PEG, 磺酸盐^[11]或磷酸盐^[12]等结构。

图8. （A）带有不同长度PEG的ADC及连接子断裂机制

图9. ADC在SD大鼠中的药代动力学和耐受性。a、四种ADC在3 mg/kg给药SD大鼠后的血浆药代动力学。b、SD大鼠在20毫克/公斤剂量后的生存情况。每组6只大鼠，PEG链较短的ADC由于组织更快的非特异性摄取，导致耐受性降低^[10]

连接子的设计除了对ADC的PK和毒性产生影响外，对药效也会产生明显的影响，因为连接子的设计直接影响有效载荷的释放效率。Zhang等^[13]报道了在靶向CD22的BJAB.Luc小鼠模型上评估不同连接子释放药物的效率。在相同给药剂量下（20 mg/kg），在连接子上带有二甲基的ADC药物3显示出比ADC药物1释放更多的有效载荷MMAE（42.1比19.1 nmol/L）和肿瘤生长抑制率（69%比50%）。带有PABC的连接子药物2可以进一步提高肿瘤组织中MMAE的浓度（87.1纳摩尔/升），以及30%肿瘤消退率（图10）。

图10. 连接子结构设计影响MMAE的释放效率

为了提高偶联药物的药效，避免或降低有效载荷的耐药性是偶联药物的发展方向。偶联药物大多使用细胞毒药物作为有效载荷，但很多细胞毒药物都是外排转运体MDR1的底物，是细胞毒药物产生耐药的重要原因。大多数报道的MDR1底物是疏水性的。Kovtun设想如果美登木素类化合物通过亲水连接子连接到抗体上，产生的代谢物将是亲水的，因此可能不是MDR1底物，从而避免MDR1介导的耐药性^[14]。为了验证这个想法，他们设计了ADC药物4和连接子上带有4个PEG的ADC药物5（图11），在内化进入靶细胞后，其被溶酶体分别代谢成6和7，由于7的亲水性强，其是外排转运体的底物概率降低，所以能发挥更好的药效。这个假设在表达和不表达MDR1外排转运体的肿瘤小鼠模型上得到了验证。在相同给药剂量下，ADC药物5比ADC药物4在HCT-15和COLO 205MDR（均表达MDR1）肿瘤小鼠模型上表现出更好的药效，并且药效与给药剂量呈现正相关性。由于两个药物相似的耐受性，因此5比4显示出改善的治疗指数。在COLO 205（不表达MDR1）的肿瘤小鼠模型上，相同给药剂量下，ADC药物5与ADC药物4没有药效学上的差异。这个例子很好的阐明了通过改变偶联药物的连接子改善有效载荷的耐药性，从而提高药物的治疗指数。

图11. 美登素类ADC连接子设计及其细胞内代谢

图12. 2个ADC在3个剂量170、340、680 μg/kg下单次皮下注射移植人结肠癌HCT-15、COLO 205MDR和COLO 205细胞的小鼠肿瘤模型中的药效^[14]

偶联药物的药效也可能与“旁观者效应”相关。“旁观者效应”涉及两个作用机理（图13）^[4]。当偶联药物到达肿瘤细胞附近，通过与肿瘤细胞的抗原结合，通过胞吞作用在细胞内释放细胞毒性有效载荷（图13 A）。在某些情况下，有效载荷可能具有足够的膜渗透性，会扩散出细胞并杀死周围的肿瘤细胞。或者，偶联药物不通过内化，而是在到达肿瘤细胞微环境中，连接子断裂释放出有效载荷（图13 B），不仅对靶细胞产生杀伤，对附近的非靶向细胞也会产生杀伤。“旁观者效应”一般要求可切割型的连接子，不可切割的连接子通常不能发挥旁观者效应，因为降解的带电氨基酸药物通常缺乏细胞渗透性。DS-8201 (enhertu）在治疗Her2低表达乳腺癌患者的III期临床上大获成功，很大程度上归因于释放的有效载荷渗透至周围的细胞，产生“旁观者效应”，让附近无HER2表达或低表达的肿瘤细胞受到杀伤作用。同时有效载荷较短的血浆半衰期（1.37 h），有利于系统毒性控制。

 图13. 偶联药物的“旁观者效应“机理^[4]

四、连接子体外裂解实验

药明康德DMPK根据偶联药物连接子的断裂与否，以及断裂方式的不同，建立了体外评估连接子稳定性的实验，也可以对其代谢产物进行鉴定（图14）。如果是酸切割的连接子，可以使用不同pH值的缓冲液来模拟体内的酸性环境。如果是VC-PABC型的连接子，可以使用组织蛋白酶B来模拟细胞内酶切割。针对还原型的二硫键，可以在缓冲液中开展GSH稳定性。对于不可裂解型连接子，可以在人溶酶体中评估其稳定性。在其他基质中，如肝S9或肝匀浆液、肾S9或肾匀浆液、血浆和肿瘤细胞中也可以开展体外稳定性实验或代谢产物鉴定实验（图15）。这些连接子体外裂解实验的建立，希望能助力行业内偶联药物的研发。

图14. 药明康德DMPK平台评价连接子释放药物的实验类型

图15. 药明康德DMPK平台评价偶联药物稳定性的其他基质

结语

随着偶联药物的开发和经验的积累，连接子已成为偶联药物设计的关键元素。四大传统类型的连接子各有特点，在偶联药物设计过程中，应结合其特点，扬其所长，避其所短。一些新机制的连接子也在开发中，如借助外来物释放有效载荷，成为可裂解型连接子开发的新方向。随着这些技术的打磨和精进，相信会有越来越多的精准释放的偶联药物上市。

附图1. 常用有效载荷结构

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。 

点击此处可与我们的专家进行联系。

作者：程起干，贺玺琳，金晶

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟