体内生物样品中氨基酸的分析挑战及检测策略

据研究统计，由氨基酸代谢障碍引发的疾病已超过400种，涉及心血管系统、中枢神经系统（脑与脊髓）、消化系统（胃肠道、肝脏）及泌尿系统（肾脏）等多个重要组织器官。针对这些疾病，药用氨基酸被用于直接调节体内氨基酸水平，帮助机体维持正常的生理功能。

根据药理作用及临床应用，目前市售药用氨基酸主要可分为以下五类：

1. 营养支持类：补充必需与非必需氨基酸，用于营养不良或术后恢复；

2. 器官功能保护类：如保肝类，促进肝细胞修复或解毒；

3. 神经调节类：如神经递质前体或类似物，参与中枢神经系统功能调节；

4. 免疫调节类：激活免疫细胞或抗体合成，调节免疫应答；

5. 解毒类：如与重金属、代谢毒素形成稳定螯合物，加速体内毒物排出。

此外，随着代谢组学、肿瘤生物学和肿瘤重编程理论的兴起，氨基酸代谢成为抗肿瘤研究的新焦点^[1]。氨基酸不仅作为氮供体参与生物大分子的合成，影响肿瘤细胞增殖、侵袭和免疫逃逸过程；同时作为重要的代谢调节分子，通过调控免疫细胞的活性，影响肿瘤微环境的免疫应答^[2]。这种双重作用机制使得氨基酸的代谢变化不仅成为监测癌症进展的关键临床指标，同时也为开发靶向治疗策略奠定了重要的理论基础。越来越多的药物致力于通过调节肿瘤相关的氨基酸代谢来选择性杀伤肿瘤细胞，为癌症治疗开辟新的研究方向（表1列出了部分靶向氨基酸代谢的抗肿瘤药物）。本文将围绕氨基酸作为内源小分子生物标志物在体内的重要作用，着重探讨其在体内生物样品分析中面临的挑战及检测策略。

表1. 靶向氨基酸代谢的抗肿瘤药物^[3]

氨基酸结构及其重要的生物学功能

氨基酸的定义及结构分类

氨基酸是一类同时含有氨基和羧基的有机化合物，其基本结构如图1所示。根据侧链R基团的碳骨架结构不同，分为脂肪族、芳香族和杂环氨基酸；根据R基团的极性不同，分为极性和非极性氨基酸；根据氨基酸分子中氨基（-NH₂）和羧基（-COOH）的比例不同，分为酸性、中性、碱性氨基酸；根据氨基酸手性中心的立体构型不同，分为L构型和D构型氨基酸。不同氨基酸独特的化学结构赋予其不同的理化性质，这些性质决定了它们在生命活动中的关键作用。

图1. 氨基酸结构通式

氨基酸的生物学功能

氨基酸作为生命活动不可或缺的核心分子，在人体中发挥着多维度的重要功能，包括参与能量供应、生物合成以及表观遗传调控、蛋白翻译后修饰和免疫调节等复杂生理过程。

• 能量供应（如图2.1）

支链氨基酸（BCAA）是一类脂肪族必需氨基酸，人体每天摄入的BCAA中约有20%会代谢转化为乙酰辅酶A，随后进入三羧酸循环生成三磷酸腺苷（ATP），为机体提供能量。

• 生物合成（如图2.2）

氨基酸不仅是蛋白质、脂类、核酸等重要大分子的合成原料，还参与多种生物小分子的合成。例如，含硫氨基酸可通过反转硫化途径生成半胱氨酸，进而作为底物参与谷胱甘肽的合成。谷胱甘肽作为细胞内的主要抗氧化物质，通过向活性氧提供电子，阻止其对正常细胞电子的夺取，从而保护细胞免受慢性损伤和炎症的侵害。

• 表观遗传、蛋白修饰及免疫调节（如图2.3）

赖氨酸的降解产物通过乙酰化作用参与表观遗传和蛋白质翻译后修饰；氨基酸衍生物如犬尿氨酸可通过调节免疫细胞活性影响免疫应答。

氨基酸参与的生理过程都与维持细胞稳态和正常功能密切相关，因此被誉为“生命的基石”。当其浓度水平出现异常，便可能引发一系列病理生理疾病。

图2. 氨基酸的生物学功能^[3]

因此，氨基酸检测已成为现代健康诊断与疾病筛查中不可或缺的关键技术手段。通过动态监测人体内氨基酸代谢的变化，为疾病早期预警、病理机制解析及个体化干预提供科学依据。以市面主流的氨基酸谱检测技术为例，该技术能够精确量化血液、尿液、脑脊液等多种生物样本中氨基酸的浓度，并结合代谢组学模型，揭示氨基酸在不同生理循环（如肝肠循环、血脑屏障转运）中的分布特征与动态变化。例如，苯丙酮尿症患者血清中苯丙氨酸水平的异常升高、肌萎缩侧索硬化症患者脑脊液中谷氨酰胺/谷氨酸比值失衡，均可通过氨基酸谱检测实现快速识别，从而为临床诊断治疗提供有力支持。

氨基酸的分析检测平台

如图3所示，目前氨基酸的分析检测主要依托氨基酸分析仪（Amino Acid Analyzer）、气相色谱-串联质谱联用技术（GC-MS/MS）、核磁共振（NMR）以及液相色谱-串联质谱联用技术（LC–MS/MS）4种技术平台，这些技术平台各有其独特的优势与局限，研究人员可根据实验目的及样品特性，灵活选择最适配的检测平台以实现精准分析。

图3. 氨基酸分析平台对比^[4]

其中LC-MS/MS技术凭借其高灵敏度、广泛的检测范围及卓越的选择性，已成为氨基酸药代动力学研究中的首选分析平台，该技术融合了液相色谱的高效分离能力及质谱的高灵敏度、高选择性优势，尤其适用于复杂生物样本中氨基酸的定性与定量分析。

LC-MS/MS平台在氨基酸生物分析中的挑战及应对策略

在基于LC-MS/MS平台的生物样品分析方法开发中，氨基酸的结构特性引发多重技术挑战，具体表现为：氨基酸极性大导致在反相色谱保留能力弱；手性中心的存在引发异构体分离难题；部分氨基酸在生物基质中稳定性差且易受内源性干扰。药明康德DMPK依托丰富的实战经验与技术积累，针对上述难点开发了系统性解决方案，成功实现高灵敏度、高选择性的精准分析，为药代动力学研究与生物标志物检测提供可靠的数据支持，从而进一步提升新药研发效率。下文将详细探讨这些技术挑战及其应对策略。

氨基酸反相色谱保留

作为典型的大极性小分子化合物，氨基酸因其强亲水性导致在反相色谱体系中与疏水性固定相亲和力不足，存在保留能力弱的难题。针对这一问题，药明康德DMPK在LC-MS/MS平台上开发并优化了多种适用于大极性化合物的分析方法（见表2），并对各方法的性能特征进行了系统对比。

表2. 大极性化合物分析方法对比^[5]

相比而言，HILIC亲水作用色谱整合了液液分配、离子交换及氢键作用等多种分离机制，是一种相对简单且普适性强的分析技术，成为体内生物样品中氨基酸分析的首选方法。在应用该项技术进行氨基酸分析时，需重点关注以下参数的优化：

• 样品提取溶剂

  在常规HILIC模式下，乙腈通常作为首选样品提取溶剂，以增强分析物的保留；而针对氨基酸类化合物，常采用醇类试剂与乙腈混合作为提取溶剂，以提高溶解度。

• 初始有机相占比

  在HILIC分离体系中，分析物保留能力与流动相中有机相比例呈正相关。其作用机制主要依赖于固定相表面吸附流动相中水分形成的动态亲水层（为激活亲水分配效应，亲水层需要维持至少5%的水含量）。当水相比例超过50%，亲水层结构瓦解，分配效应主导的保留机制被破坏，化合物不再保留^[6]。

• 缓冲液

  缓冲液的引入可强化分析物与固定相间的离子交换及氢键作用，改善峰形及分离度，但需权衡其对MS灵敏度的抑制效应。

• 流动相pH

  pH通过影响分析物电离状态及色谱填料表面电荷来调节其保留行为：高pH有利于酸性化合物的保留，低pH有利于碱性化合物的保留。

• 流速

  随着液相方法流速的升高，分析物保留能力呈现梯度衰减且色谱峰宽随之锐减，需综合评估色谱柱粒径参数与耐受压力阈值，确立最佳流速。

• 柱温

  升高柱温一般会减弱分析物的保留能力，同时流动相粘度的下降可提升传质效率，从而提高柱效；降低柱温会增大分析物在固定相-流动相之间的分配系数差异，从而提高选择性。

氨基酸手性分离

氨基酸作为生物体内重要的手性分子，其手性分离在药物代谢研究、疾病诊断及生物标志物分析中至关重要。为解决这一难题，目前主流的解决方案主要分为以下两类：

衍生化间接分析法

通过手性衍生化试剂，将对映体转化为理化性质显著差异的非对映异构体，利用反相色谱柱实现分离。图4是一种使用三嗪型手性衍生试剂通过反相色谱柱分离D/L-丙氨酸，并通过LC-MS/MS进行分析的案例^[7]。

图4. (a)D/L-丙氨酸与三嗪型试剂DMT-(S)-Pro-OSu的衍生化反应；(b)衍生化产物的LC-MS/MS谱图

手性色谱柱直接分析法

该方法通过采用环糊精、大环抗生素或蛋白质键合手性固定相色谱柱，基于立体选择性相互作用（如氢键、π-π堆积等）直接拆分对映体，是手性分离的经典方法。

然而，面对复杂生物基质中对映体的快速精准分析需求，传统色谱技术在高通量、低溶剂消耗及质谱兼容性方面仍存在一定局限。为此，药明康德DMPK建立了UPCC-MS/MS平台，该技术融合了气相色谱的低粘度、高扩散性以及液相色谱的广泛适用性等优势，显著提升了分离效率，成功实现了从小分子药物到多肽药物的精准拆分，进一步拓展了手性分离的能力。（扩展阅读：基于UPCC-MS/MS&UPLC-MS/MS双分析技术平台的手性药物DMPK研究策略）

氨基酸稳定性

氨基酸类化合物普遍表现出良好的基质稳定性，但在复杂的生物样品中，特定结构或环境因素仍可能引发稳定性问题。下面将通过案例说明其不稳定性成因及应对策略。

案例1 半胱氨酸二聚化

不稳定机制：半胱氨酸分子中的游离巯基（-SH）易与其他巯基化合物（如另一分子半胱氨酸）发生氧化反应，形成二硫键连接的二聚体（结构通式如图5a）。

解决策略：在样品前处理阶段加入还原剂（如TCEP、DDT等），通过切断二硫键将二聚体还原为单体（结构通式如图5b），确保定量分析的准确性。

图5a. 游离巯基氧化成二聚体

图5b. TCEP切断二硫键还原成单体

案例2 肝匀浆中精氨酸酶促降解

不稳定机制：在肝脏组织基质中，精氨酸酶呈现高活性表达，催化精氨酸生成鸟氨酸和尿素（代谢路径见图6）。

图6. 精氨酸在精氨酸酶条件下催化生成鸟氨酸的代谢路径^[8]

解决策略：采用同位素标记的精氨酸作为目标分析物，以排除内源性干扰，通过设计“向基质中添加/不添加1M柠檬酸”对照实验，验证精氨酸的代谢，同时监测代谢产物鸟氨酸的生成。图7中精氨酸和鸟氨酸的质谱响应变化表明，在肝匀浆液中添加1M的柠檬酸能有效抑制鸟氨酸的生成。推测柠檬酸溶液可有效抑制精氨酸酶的活性，从而抑制精氨酸向鸟氨酸的转化。药明康德DMPK针对生物基质稳定性这一技术难题，已建立一套系统的解决方案。（扩展阅读：生物基质中分析物不稳定的原因及解决策略）

图7. 80%MeOH水溶液为匀浆液（上图）以及添加1M的柠檬酸溶液的匀浆液（下图）中精氨酸及鸟氨酸的质谱响应

氨基酸内源性

氨基酸作为内源性物质，实际生物基质中通常含有未知量的目标分析物，容易对检测结果产生干扰。针对这一挑战，可以采用以下四类方法实现精准定量：

• 替代基质法；

• 替代分析物法；

• 背景扣除法；

• 标准加入法。

替代基质法：使用不含分析物的替代基质配制标准曲线（优先匹配真实样本的理化参数，如pH、离子强度、蛋白含量等），有效避免真实基质中内源性干扰，是定量检测内源性化合物的首选方法。

替代分析物法：引入体内不存在或天然含量极低，但经过验证和校正后与目标分析物信号一致的替代分析物（如稳定同位素标记物、结构修饰衍生物），通过建立替代物与目标分析物的信号响应关联模型进行检测的方法。

背景扣除法：通过同步检测空白基质与实际样本，从样本信号中扣除空白的本底信号，消除固有干扰，从而准确量化分析物的真实浓度。

标准加入法：通过向实际样本中系列添加已知浓度的目标分析物标准品，构建加标浓度-响应曲线，利用线性回归外推法计算样本中分析物的浓度。（扩展阅读：药物研发中生物标志物的应用及检测技术和方式）

结语

作为代谢组学的重要研究内容，氨基酸及其衍生物的分析需求正随着精准医疗的发展日益增长，而多组分氨基酸同步检测及痕量氨基酸衍生物的定量测定，将对分析方法提出更高挑战。药明康德DMPK在氨基酸及其衍生物检测方面积累了丰富的分析经验，已成功建立了多种氨基酸检测方法，实现对多种生物基质（如血浆、尿液、组织等）中氨基酸的高通量、高效率定量分析，为客户提供一体化服务，助力药物研发进程。

作者：赵雅楠，高莉，任彦甫，邢丽丽

编辑：富罗娜·克里木，钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹

药明康德DMPK依托中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1700个新药临床研究申请（IND）。

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