配体结合测定法（LBA）在寡核苷酸药代动力学定量分析中的应用

随着寡核苷酸药物研发的不断发展，寡核苷酸的化学修饰和递送系统技术取得了巨大进展，增加了寡核苷酸药物的稳定性和靶向性，延长体内半衰期，从而提高药效，最大限度地减少给药次数和剂量。由于寡核苷酸的种类繁多，以及多元化的化学修饰和药物递送技术，应选择合适的检测平台进行药代动力学分析、药物代谢和组织分布评估，其中液相色谱-质谱联用（Liquid Chromatography–Mass Spectrometry, LC-MS）具有高特异性和较宽的线性范围，但是通常需要复杂的样品前处理并具有较低的样品通量。配体结合测定法（Ligand Binding Assays, LBA），如基于杂交的酶联免疫吸附测定法（Hybridization based Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, HELISA）和MSD®电化学发光法（MSD® Electrochemiluminescence, MSD®ECL），具有较高的灵敏度及高通量，被广泛的用于生物样品中寡核苷酸的定量分析，支持寡核苷酸药物临床前和临床药代动力学研究。

我们将发布系列文章分别介绍寡核苷酸药物的生物分析平台，目前已发布了专题文章：《液相色谱-质谱联用在寡核苷酸药代动力学定量分析的应用》，后续还将发布LC-FL分析方法和qPCR方法的文章，欢迎持续关注。本文将介绍LBA方法的原理，优点及挑战和解决方法，基于部门经验与研究案例分享一些见解。

一、配体结合测定法原理

利用配体结合测定法（Ligand Binding Assays, LBA）检测寡核苷酸，主要指基于杂交的酶联免疫吸附测定法（Hybridization based Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, HELISA）和MSD®电化学发光法（MSD® Electrochemiluminescence, MSD®ECL）。HELISA是一种基于互补杂交的酶标固相免疫测定方法，将酶标记核酸探针与吸附在固相载体上的待测寡核苷酸直接或间接杂交结合,滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色氧化型，使其产生有色物质。通过定性或定量检测有色产物量，可确定样品中待测寡核苷酸浓度。MSD®ECL方法与HELISA工作流程类似，使用电化学发光标签标记核酸探针，通过测量电化学反应发射光的强度，以完成样品中待测寡核苷酸的定量测量。根据分析原理，LBA可具体分为：一步法、两步法、夹心法、双结合法和竞争法（见图1）。

1.一步法是仅用一个单链的核酸探针与待测寡核苷酸互补杂交形成双链体。该核酸探针一端标记有生物素，固定在链霉亲和素板上；另一端标记检测标签。一步法通过S1-核酸酶去除未形成双链体的单链探针，对带有检测标签的双链体进行定量。一步法无法区分全长的寡核苷酸和核酸酶解的代谢产物，易产生交叉杂交的现象，导致待测寡核苷酸浓度被高估。

2. 两步法需要捕获探针和检测探针。捕获探针包含与待测寡核苷酸互补的核苷酸序列和一段额外的核苷酸序列与检测探针互补。捕获探针一端标记有生物素，固定在链霉亲和素板上。待测寡核苷酸与捕获探针互补杂交，并在T4 DNA连接酶（ligase）作用下，与检测探针结合。同时，检测探针与捕获探针互补杂交，随后加入底物，检测反应信号。两步法不受3'-端分解的核酸代谢产物干扰，但是也无法区分全长的寡核苷酸和5'-端分解的核酸代谢产物。

3.夹心法也需要捕获探针和检测探针。捕获探针一端标记有生物素，固定在链霉亲和素板上；检测探针一端标记检测标签。 捕获探针和检测探针分别与待测寡核苷酸的上的一段序列互补杂交，形成双链体进行定量检测。 与一步法类似，夹心法也受到代谢产物的影响，从而导致待测寡核苷酸浓度被高估。

4. 双结合法需要捕获探针，检测探针和模板探针，有较好的特异性，且不受核酸酶解的代谢产物的干扰。捕获探针一端标记有生物素，固定在链霉亲和素板上，检测探针一端标记检测标签。模板探针可以同时与捕获探针，检测探针和待测寡核苷酸互补，并在T4 DNA连接酶作用下形成完整的双链体，随后加底物溶液，检测反应信号。

5. 竞争法需要与待测寡核苷酸序列相同的捕获探针和与待测寡核苷酸序列相互补的检测探针。捕获探针一端标记有生物素，固定在链霉亲和素板上，检测探针一端标记检测标签。待测寡核苷酸与捕获探针竞争性的与检测探针进行互补杂交，通过定量待测寡核苷酸对预计信号的干扰，来测定寡核苷酸在样品中的含量，但无法区分全长的寡核苷酸和核酸酶解的代谢产物。

图1. 杂交ELISA分析方法原理（A）一步法（B）两步法（C）夹心法（D）双结合法（E）竞争法^[1]

通常在选择分析方法时，除方法的灵敏度，还应考察方法的选择性和特异性。如有代谢产物的干扰，可选择两步法或双结合法。

二、配体结合测定法的优点

高灵敏度

与基于杂交原理的LC-FL方法类似，HELISA方法可以轻松实现0.5 ng/mL（HELISA）以及更低的检测下限0.05 ng/mL（MSD®ECL），可用于寡核苷酸药物临床前后期和临床药代动力学研究，用于低剂量组或长实验周期的生物样品检测。

MSD®ECL采用三联吡啶钌（SULFO-TAGTM）作为发光底物，SULFO-TAGTM分子量较小，因此空间位阻小，易于标记抗体，且不易妨碍其与待测物的结合。SULFO-TATGG可产生高效，稳定，连续的电化学发光信号，使得检测灵敏度得到显著得提高。MSD®ECL能同时兼顾高低丰度寡核苷酸的检测，动态范围在4-5个数量级。

高通量

与色谱方法相比，HELISA方法几乎不需要样品前处理，且不需要与色谱相关的线性进样方法，大大缩短了检测时间。此外，自动化设备如TECAN（Männedorf, Switzerland）及Hamilton（Nevada，USA）液体工作站，自动洗板机和HP D300 digital dispenser的使用，可以缩短分析人员操作的时间，提高样品检测通量，并减少手动移液错误，提高样品分析的成功率。

不受寡核苷酸化学修饰和递送系统影响

相比较于qPCR方法，基于HELISA方法对寡核苷酸化学修饰有较好的包容性，其检测灵敏度不受影响。该分析方法可用于GalNAc偶联寡核苷酸，LNP递送寡核苷酸，及其他递送系统的寡核苷酸在临床前及临床研究中生物样品的检测。

此外，MSD®ECL方法节省样本用量，可实现多重检测，为珍稀样本的研究提供了更多的数据。

三、配体结合测定法的挑战

探针的设计

在设计捕获和检测探针时，应确保对寡核苷酸分析物具有适当的亲和力，并最大限度地减少潜在的自退火，需要方法开发阶段对捕获和检测探针进行筛选。锁核酸（Locked Nucleic Acid, LNA）是一种新型核酸类似物，含有2'-O，4'-C亚甲基桥（图2），这种桥接锁定在3'-内构象中，限制了呋喃核糖环的灵活性，并将结构锁定为刚性双环形式。LNA对互补的DNA或RNA有较高的亲和力，可以提高杂交双链的热稳定性，并提高探针与靶序列杂交的特异性^[2]。使用LNA捕获和检测探针的MSD®ECL方法被用于测量临床前生物样品中血清和组织匀浆中的siRNA^[3]。

图2. DNA、RNA和LNA核苷酸的结构对比^[4]

此外，优化探针的设计也有助于提高HELISA方法的选择性。例如，如果已知有3' 或5'-端代谢物，可以优化捕获和检测探针序列长度，减少代谢产物与探针的杂交，从而提高方法的灵敏度。

代谢产物

和液相色谱-质谱联用方法（Liquid chromatography–Mass Spectrometry, LC-MS）相比，HELISA方法缺乏对生物样品中待测寡核苷酸的特异性，无法区分全长寡核苷酸和长链代谢物，如n-1和n-2，这可能会导致交叉杂交的现象，导致待测寡核苷酸浓度被高估。

因此，需要使用LC-MS方法优先开展代谢稳定性研究，并针对待测寡核苷酸和主要的代谢产物分别设计探针并开发方法，用于临床前和临床研究。此外，还可以在方法开发和验证过程中，合成并评估可能的代谢物对待测寡核苷酸的定量影响．同时选择适当的HELISA方法也可以减少代谢产物对待测寡核苷酸的干扰。如之前提到的两步法和双结合法，在实验引入T4 DNA连接酶，可以进一步提高HELISA方法的特异性。

四、利用LBA方法定量分析GalNAc-siRNA偶联寡核苷酸案例分享

我们开发了基于HELISA和MSD®ECL的两种生物分析法，用于猴血清样品中GalNAc-siRNA偶联寡核苷酸的定量分析，并对方法的特异性，选择性，灵敏度，线性范围和准确度进行方法学验证。该方法采用夹心法，利用生物素标记的LNA捕获探针与和带有检测标签的LNA检测探针与GalNAc-siRNA双链体中的反义链（Antisense strand, AS）互补杂交，检测反义链的浓度，GalNAc-siRNA的浓度将根据反义链的浓度进行报告。HELISA和MSD®ECL方法的灵敏度分别为0.5 ng/mL 和0.05ng/mL。

01 标准曲线与定量范围

图３展示了HELISA方法样品处理后加标猴血清样品的定量性能，LLOQ低至0.5 ng/mL，线性范围在0.50-50.0 ng/mL之间。

图３. HELISA方法中GalNAc-siRNA在猴血清中的校准曲线

（0.5-50.0 ng/mL, Curve Fit: 4-Parameter Logistic, Weighting Factor: 1/values2, R2=1.000）

图4展示了MSD®ECL方法样品处理后加标猴血清样品的定量性能，LLOQ低至0.05 ng/mL，线性范围在0.050-10.0 ng/mL之间。

图４. MSD方法中GalNAc-siRNA在猴血清中的校准曲线

（0.05-10.0 ng/mL, Curve Fit: 4-Parameter Logistic, Weighting Factor : 1/Y2, R2=0.9995）

02 准确度和精密度

HELISA方法中质控样品的批内准确度范围为84.2%至112.8%，批间准确度范围为98.5%至101.5%；批内精密度%RSD范围为1.7%至15.1%，批间精密度%RSD范围为6.7%至13.7%。

MSD®ECL方法中质控样品的批内准确度范围为92.3%至103.9%，批间准确度范围为95.4%至101.6%；批内精密度%RSD范围为0.9%至7.0%，批间精密度%RSD范围为2.5%至6.0%。该数据满足监管机构对于CV%(±20%)和Bias%(±20%)的法规要求。

03 代谢产物的干扰检测

在方法开发的过程中，分别检测了2个可能的代谢产物（AS 3’n-1和 AS 3’n-2）和 GalNAc-siRNA双链体中的正义链（Sense strand，SS）对MSD®ECL夹心法的干扰影响。分别配置高低两个浓度的GalNAc-siRNA，AS 3’n-1，AS 3’n-2 和SS的猴血清样品，并采用MSD®ECL夹心法进行检测。相比较于GalNAc-siRNA，2个可能的代谢产物（AS 3’n-1和 AS 3’n-2）在检测中有显著的信号相应，因此在检测猴血清样品中应对GalNAc-siRNA有较低的特异性，需要使用LC-MS方法，在检测样品前优先开展代谢稳定性研究。实验证明采用MSD夹心法对GalNAc-siRNA双链体中的反义链的定量，不受正义链的干扰。

图5展示了2个可能的代谢产物（AS 3’ n-1和AS 3’n-2）和SS链利用MSD®ECL方法在猴血清中检测到的信号响应。

图5. 利用MSD®ECL方法检测含有GalNAc-siRNA，AS 3’n-1，AS 3’n-2和SS的猴血清样品

结语

基于杂交的酶联免疫吸附测定（Hybridization based Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, HELISA），具有较高的灵敏度及高通量，被广泛的用于临床前和临床药代动力学生物样品中寡核苷酸的定量分析。

药明康德药性评价部Non-GLP生物分析团队具备全面的寡核苷酸药物生物分析能力，开发并建立了包括：液相色谱-三重四极杆质谱联用（LC-MS/MS），液相色谱-高分辨质谱联用（LC-HRMS），基于杂交的液相-荧光检测（LC-FL），配体结合检测（LBA），和定量聚合酶链反应（qPCR）5大生物分析平台，支持从早期药物筛选到IND申报的寡核苷酸生物分析，提供多样化的生物分析平台，具有丰富的寡核苷酸生物方法开发经验，可以实现高质量的体内外数据交付，加速药物研发进程。

图6. 药明康德DMPK寡核苷酸生物分析平台

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。 

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作者：孙虹，郜雅菲，李陟昱，赵楠

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟