寡核苷酸药物的“智能”递送

随着寡核苷酸药物的不断获批，并逐步迈向更旷阔的治疗领域，寡核苷酸药物将在制药行业中占据越来越重要的地位，有望为更多尚难成药的疾病领域带来突破性疗法。

尽管已有多款寡核苷酸药物成功上市，但该类药物的递送仍然是研发中的难点，亟待进一步突破。因其自身的物理化学特性，未经修饰的游离寡核苷酸药物在给药后不仅会很快被机体清除，难以到达目标RNA产生治疗效果，同时还有脱靶和产生毒副作用的风险。因此，核酸类药物多需要同时借助化学修饰和合适的递送系统来达到治疗目的。化学修饰对于寡核苷酸药物的递送起到了非常重要的作用，但单纯通过化学修饰还是很难使小干扰RNA (siRNA) 药物到达靶部位，反义寡核苷酸(ASO)药物的递送也差强人意，因此，递送系统成为了寡核苷酸药物研发中成功的关键，也是药物研发公司的技术护城河。目前，siRNA药物研发的头部企业均具有自己研发或授权的递送技术平台。未来，研发企业在递送系统上的突破，无疑将成为其占据市场先机的敲门砖。siRNA药物的递送系统在各类核酸药物研发中相对成熟，本文将从siRNA药物的递送系统切入来探讨核酸类药物的递送技术。

一、已上市siRNA药物的递送系统

我们可以把siRNA药物的体内过程划分为三个主要阶段，机体在每个阶段都为siRNA药物设置了不同的生物屏障：

到达靶组织

给药后，siRNA首先需要躲避血浆和组织中核酸酶的降解、免疫系统的捕获，顺利到达靶组织；

进入细胞

由于siRNA药物较大的分子量且表面带有负电荷，即使到达靶组织也无法自由通过细胞膜，需要通过胞吞进入细胞；

溶酶体逃逸

siRNA需要在内吞体与溶酶体结合前实现逃逸，进入细胞质，与目标mRNA结合实现基因沉默^[1]。

递送系统的主要任务和职责就是保护siRNA跨越所有生物屏障，顺利到达细胞质，与目标mRNA结合，进而沉默基因发挥药效。

1.1 脂质纳米粒递送系统

由于siRNA本身的电荷特征，阳离子脂质体似乎是最佳的递送系统候选者。然而，传统阳离子脂质体的毒性，使得siRNA药物的研发阻力重重。Alnylam公司通过使用Arbutus公司的可离子化阳离子脂材为寡核苷酸的成功递送带来了突破，2018年首款以脂质纳米粒为递送系统的siRNA药物Onpattro获批上市，用于治疗由遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性 (hATTR) 引起的多发性神经疾病。

这类脂质纳米粒递送系统的成功关键是使用了可离子化的阳离子脂材。这些脂材在不同的pH条件下表现出不同的带电特征，在酸性pH值条件下可离子化脂材带正电荷，而在生理pH条件下基本呈中性。脂材的可离子化特性为siRNA跨越生物屏障提供了智能化的保护^[2] （图 1）：

首先，siRNA药物的生产过程需要在较低的pH值条件下完成。生产过程中，可离子化脂材带正电荷，实现稳定且最优的siRNA药物包封率；通过在脂质体中加入PEG化脂材以获得粒径在100nm或更小的脂质体。脂质体的大小（20nm-100nm）可以通过变化PEG化脂材与脂质体中其他脂材的比例来进行调控。

给药后，在血浆中，脂质体递送系统呈现基本中性的电荷表面，与PEG化脂材共同帮助siRNA药物躲避免疫系统的捕获和核酸酶的降解； 

随着PEG脂材从脂质体表面解离，运载siRNA的脂质体通过内吞作用进入细胞内。由于内吞体的pH较低，可离子化脂材逐渐质子化并带有正电荷进而破坏磷脂双分子层的稳定结构，实现siRNA内吞体逃逸；逃逸后的siRNA药物进入到细胞质中，与目标mRNA结合，实现基因沉默。

图1. 脂质纳米粒 (LNP) 介导siRNA体内递送过程

通过对300多种可离子化脂材的设计和筛选，最终Onpattro选定具有最理想pKa特征的可离子化脂材DlinMC3DMA。在临床试验中，以DlinMC3DMA为基础的脂质体显示出比第一代可离子化脂材更优的治疗效果，血清中甲状腺素转运蛋白降低超过80% （图 2）。

图 2. a. ALN-TTR01（基于DLinDMA的第一代配方）和 b. ALN-TTR02（基于DlinMC3DMA的第二代配方）的I期临床试验中血清内转甲状腺素（TTR）沉默百分比

1.2 GalNAc递送系统

GalNAc-siRNA偶联物的递送技术近年来因其高效的肝脏靶向性和良好的安全性受到了核酸药物研发机构的关注。N-乙酰半乳糖胺 (GalNAc) 是去唾液酸糖蛋白受体 (ASGPR) 的配体，去唾液酸糖蛋白受体在肝细胞的膜表面高度特异性表达（每个细胞约500,000 ASGPR）。GalNAc-siRNA偶联物通过特异性结合ASGPR，在细胞内吞作用下，将siRNA从细胞表面转运至细胞中。随后，GalNAc-siRNA偶联物与ASPGR分离，ASPRGR回到细胞表面而GalNAc-siRNA偶联物进一步解离，释放出的游离siRNA在细胞质中沉默基因发挥药效（图 3）^{[3, 4]}。siRNA有义链的3'末端通过化学键与具有三价结构的GalNAc结合，并通过ESC (enhanced stabilization chemistry) 技术增强GalNAc-siRNA偶联物的稳定性，达到提高肝脏暴露量，延长基因沉没时间的效果^[4,5]。目前已有多款GalNac-siRNA药物上市（表 1）。

图 3. GalNAc-siRNA偶联物体内递送过程

表 1. 已上市的GalNac-siRNA偶联药物

二、递送系统对siRNA药物药代动力学特征的影响

递送系统从给药部位一直护送siRNA药物到达细胞，在离开递送系统前，siRNA多与递送系统以复合物的形式存在，因此，递送系统影响着siRNA药物的体内过程和生物分布。Swart等人通过采用定量全身放射自显影技术 (QWBA) 和基质辅助激光解吸电离质谱成像 (MALDI-MSI) 技术，分别对3H标记的游离siRNA和脂质纳米粒包裹的的siRNA的组织分布进行测定。QWBA研究结果显示，单次静脉给予游离siRNA后，动物的肾脏和唾液腺显示出最高的放射性，而给予脂质纳米粒包裹的siRNA后，放射性水平最高的组织为动物的肝脏和脾脏，并可持续>168小时的时间。MALDI-MSI成像结果显示，阳离子脂材的分布与siRNA的放射性分布一致，提示siRNA应该和脂材一起循环并以纳米粒子复合物的形式分布于组织中^[6]。递送系统通过改变游离siRNA的组织分布特征，实现靶向性并有效延长siRNA药物的体内滞留时间。

普遍认为，脂质纳米粒递送系统多具有被动的肝脏靶向作用，而GalNac-siRNA偶联递送系统则通过去唾液酸糖蛋白受体的配体GalNac实现主动肝脏靶向作用。调整递送系统中各组分的结构、比例或粒子大小，以及对寡核苷酸结构进行修饰，都可能使siRNA药物的组织分布和基因沉默效果产生显著变化。以Onpattro为例，可离子化脂材最优的pKa值在6.4左右，偏差仅0.5个单位的pKa可能导致药效降低100倍。为使Onpattro迅速分布到肝脏靶组织，科学家研发出了C14烷基链PEG化脂材，这类短链PEG化脂材与传统PEG化脂材相比，可以在体内更快的从脂质体表面解离，使得没有PEG包裹的脂质体迅速吸附内源性的载脂蛋白E (ApoE)，触发肝细胞表面的ApoE受体，将脂质体内吞进入肝细胞。GalNac-siRNA递送系统中，三价或四价配体比单价或二价表现出更高的去唾液酸糖蛋白受体亲和力，因此，递送系统中选择三价GalNAc与siRNA组成偶联物。通过Advanced ESC技术对siRNA进行结构修饰后，GalNac-siRNA偶联物在肝脏中的暴露量显著提高 （图 5）^[7]。对各组分结构和比例的精细化研究是寡核苷酸类药物获得靶向分布和最优药效的关键。

图 4. C57BL/6小鼠通过皮下注射2.5 mg/kg（ESC）或0.75 mg/kg（advanced ESC）的TTR-siRNA-GalNAc偶联物，

并通过qPCR进行肝脏中siRNA定量

三、寡核苷酸药物递送系统的研发展望

目前已上市或进入临床研究阶段的siRNA药物的适应症，多集中在肝脏或肝脏相关的疾病领域，这与肝脏靶向递送系统的成功研发密不可分。拓展适应症领域，有效地靶向其他组织器官是现阶段寡核苷酸药物研发企业关注的重点。

研究表明，siRNA通过偶联不同脂质（饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、胆固醇、维他命等）可以实现在心脏、肺脏、脂肪、肌肉等不同组织中的分布和释放。Arrowhead的TRiM™ (Targeted RNAi Molecule) 平台^[8]或将有望引领这一扩展，覆盖多个组织，包括肝脏、肺和肿瘤等。该平台利用配体介导的传递，实现组织特异性靶向。TRiM™平台包含一个高效的RNA触发器，可以为每个候选药物优化具有高亲和力的靶向配体、增强药代动力学的结构，以及特异性的核酸序列，以实现靶向给药，保持最佳药理活性和安全性。另一家以穿膜环肽 (Cyclic Cell-Penetrating Peptide) 为核心技术的初创企业也值得我们关注，Entrada Therapeutics的内体逃逸载体 (Endosomal Escape Vehicle (EEV™)) 平台^[9]旨在开发细胞内疗法。EEV™技术平台通过化学修饰与寡核苷酸、抗体等各类药物连接并将其运送到靶标细胞的胞浆中。临床前研究显示超过90%的EEV结合物可以被机体组织吸收，进入细胞内的EEV结合物能有效且快速地从早期内吞体逃逸。科学家们观察到约50%的EEV结合物可到达细胞内靶标，这与当前许多生物制剂中不到2%的逃逸率相比有着显著的改善。siRNA通过多肽纳米颗粒递送，借助病毒载体，或在递送系统上连接抗体片段，以达到靶向肿瘤和不同疾病组织也是目前的研发热点。

图 5. TRiM™递送系统

在递送系统的研发过程中，通过药代动力学研究并结合药效学验证，量化递送系统中各组分或结构改变对药物组织分布产生的影响，是打开寡核苷酸药物“智能”化递送这扇大门的钥匙，即实现通过调节递送系统中各组分结构或比例，以靶向不同疾病组织，治疗多种适应症^[10,11]。

各类核酸药物的研发不乏共通之处，近年来，siRNA药物的递送系统也得到miRNA，ASO，mRNA等核酸药物研发公司的关注。通过与递送系统偶联，ASO的药效可以显著提升；目前已有多款GalNac-ASO偶联药物进入临床研究阶段。脂质纳米粒递送系统也被辉瑞和Moderna公司成功用于治疗COVID-19的mRNA疫苗^[12]。

结语

1978年，Zamecnik和Stephenson首次发表了反义寡核苷酸作为治疗目的的研究成果，20年后的1998年，第一款ASO药物获批上市；1998年Fire和Mello发现了RNA干扰，同样经过了20年的时间，在2018年首款siRNA药物获批上市。似乎每历经20年的时间，寡核苷酸药物的研发都会获得突破性进展。目前，寡核苷酸药物研发已经进入一个全新的20年，随着对该类药物研究技术的不断成熟和越来越多制药企业的加入，相信这20年将是寡核苷酸药物加速发展的全新时代。

药明康德DMPK密切关注各类核酸药物递送系统的研究动态。我们的团队已经建立GalNac、脂质纳米粒等递送系统的寡核苷酸药物药代动力学研究策略和全方位的测试平台，可以高效支持全球客户的寡核苷酸药物研发项目。我们的科研人员将持续关注核酸类药物递送系统的最新研究进展，为全球客户提供针对不同递送系统的药代动力学研究策略和测试服务。

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作者：李想，金晶

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟